Beckman Coulter IM3632 User manual

B60231–AE
Stem-TrolControlCells
IM3632
TABLEOFCONTENTS
English........................................................2
Français(FR).....................................................9
Deutsch(DE)....................................................16
Italiano(IT).....................................................23
Español(ES).....................................................30
PortuguêsPortugal(PT-PT)..............................................38
Dansk(DA).....................................................45
Svenska(SV)....................................................52
Ελληνικά(EL)....................................................59
Magyar(HU).....................................................67
Polski(PL)......................................................74
Čeština(CZ).....................................................82
Türkçe(TR).....................................................89
Русский(RU)....................................................96
Română(RO)....................................................104
Latviešu(LV).....................................................111
PortuguêsBrasil(PT-BR)...............................................118
APPENDIX.....................................................125
REFERENCES....................................................127
©2019BeckmanCoulter,Inc.Allrightsreserved.

B60231–AE2of128
Stem-TrolControlCells
IM3632
ForInVitroDiagnosticUse
INTENDEDUSE
Stem-TrolControlCellsisanassayedqualitycontrolproductforimmunophenotypinganalysisusingCD45and/
orCD34monoclonalantibodiesreagentsandowcytometry.Itprovidesapositivecellcontrolthatisprocessed
inthesamemannerasabloodspecimenwhenStem-TrolControlCellsarespikedintoaperipheralwholeblood
sample.Thisallowsvericationofreagentperformanceandthemethodsusedforstainingtargetedcells(i.e.
CD34+HematopoieticProgenitorCellsHPC),lysingerythrocytes,andanalyzingsampleswithowcytometry.
RefertotheStem-KitReagents(Ref.IM3630)packageinsertforcompleteinstructionsifperformingmanual
analysis.RefertothestemCXPSystemGuideprovidedwiththestemCXPSystemSoftwareforcomplete
instructionsifusingtheautomatedanalysis.
SUMMARY
Immunophenotypinganalysisusingowcytometryinvolvestheidenticationandenumerationoftargetedcells
inbiologicalspecimens.Thespecimensofinterestarestainedwithmonoclonalantibodiesanderythrocytesare
lysedpriortoowcytometricanalysis.Apositivecellcontrolisrequiredtoverifyreagentperformance,sample
preparationmethods,andstainingprocedures(1).Apositivecellcontrolshouldmimicarepresentativetargeted
cellintermsofmonoclonalantibodyperformance,erythrocyteslysing,andowcytometricanalysis.
Stem-TrolControlCellsisaliquidpreparationofstabilizedKG-1aderivedcellsthathaveantigenexpressionand
CD45andCD34stainingpropertiesrepresentativeofthosefoundonCD34+HPC.
PRINCIPLE
Stem-TrolControlCellsarepreservedKG-1acellsthathavebeenmodiedandstabilizedtoexpresstheCD34
classIIIepitopes(2)andtheCD45leukocytecommonantigenatdensitiesthatapproximatenormalimmature
humanhematopoieticcells.AmixtureofStem-TrolControlCellsspikedintonormalfreshwholebloodisrststained
withthemonoclonalantibodyreagentsand7-AADViabilityDyeandthenlysedtoremoveerythrocytes.Stem-Count
orFlow-CountFluorospheresareaddedforthedirectdeterminationofabsolutecounts.Flowcytometricanalysis
ofthestainedandlysedpreparationdeterminestheabsolutecountofthetargetedcells.Expectedresultsare
determinedusingStem-KitReagentsonvalidatedandstandardizedFC500owcytometersystemsequippedwith
CXPSystemSoftware(Version2.0)toanalyzesamples.
REAGENTS
Stem-TrolControlCellsissuspendedinanisotonicsolution,containingstabilizersandBSA.TheAssayedCell
concentration(cells/µL)isderivedfrommultiplereplicateanalysesusingthereferencemethod.Thespecicvalue
islocatedontheviallabel.
WARNINGANDPRECAUTIONS
1.Specimens,samples,andallmaterialcomingincontactwiththemshouldbehandledasifcapableof
transmittinginfectionanddisposedofwithproperprecautions.
2.Neverpipetbymouthandavoidcontactofspecimensorreagentswithskinandmucosa.
3.Donotusereagentbeyondexpirationdateonviallabel.
4.Donotfreezereagents.
5.Donotexposereagenttoheatduringstorageoruse.
6.Avoidevaporationandleakageofreagentbycappingvialstightlyafteruse,orerroneousresultsmayoccur.
7.Stem-TrolControlCellswillsettleoverextendedperiods.Ensurethatthecellsarecompletelyresuspended
beforeuse.Avoidexcessivemixingtominimizetheformationofairbubbles.Donotpipetteairbubblesor
erroneousresultsmayoccur.
8.UseacalibratedpositivedisplacementorrepeaterpipettodispensesamplesandStem-TrolControlCells,or
erroneousresultsmayoccur.
9.Usepipettingtechniquesrecommendedbythepipetmanufacturertoensureaccurateandprecisepipetting
ofsamplesandStem-TrolControlCells,orerroneousresultsmayoccur.
10.EachlotofStem-TrolControlCellshasaspecicconcentrationofcells.Ensurethecorrectassayed
concentrationisusedwhendeterminingabsolutecountresults.

B60231–AE3of128
11.Incubationormixingtimesortemperaturesotherthanthosespeciedmaygiveerroneousresults.
12.Erroneousresultsmayoccuriftheowcytometerisnotproperlyalignedorstandardizedforuorescenceor
ifthecellpopulationsareimproperlygated.
13.Resultsdeterminedusingowcytometers,lysingsystems,orantibodiesthataredifferentfromthoseusedto
determinetheexpectedresultsmaynotfallwithintheexpectedrange.
14.Usegoodlaboratorypracticeswhenhandlingthisreagent.
GHSHAZARDCLASSIFICATION
Notclassiedashazardous
SafetyDataSheetisavailableat
beckman.com/techdocs
STORAGE,STABILITY,ANDDISPOSAL
•Reagentstability:thisreagentisstableuptotheexpirationdatestatedontheviallabelwhenstoredunopened
at2–8°C.Donotuseafterexpirationdate.Openvialstabilityis30days.
Openedvialsmustbecappedtightlyandstoredat2–8°Cafteruse.Donotfreeze.
•BringStem-TrolControlCellstoroomtemperature(18–25°C)priortouse.
IMPORTANT:RiskoferroneousresultsifleakageoftheStem-TrolControlCellsoccurs.Onceopened,
Stem-TrolControlCellsmustbestoredinanuprightpositiontopreventthepossibilityof
leakage.Reagentsshouldnotbeusedifsignsofleakageareobserved.
EvidenceofDeterioration
Inabilitytoobtainexpectedresultsorashiftinlightscatteroruorescencepropertiesmayindicateproduct
deterioration.Instrumentstandardization,samplepreparationtechnique,andantibodyperformanceshouldalso
beinvestigated.
AnychangeinthephysicalappearanceofStem-TrolControlCells(normalappearanceisacolorlessliquid)or
anymajorvariation(>15%changeinabsolutecount)invaluesobtainedfromreplicatedtestsbyowcytometry
analysis,mayindicatedeteriorationandthereagentshouldnotbeusedfurther.
ReagentPreparation
Stem-TrolControlCellsisaready-to-usecellsuspension.Propermixing(vortexfor10–12seconds)isrequired
beforeeachrstpipettingfromthevial.Avoidexcessivemixingtominimizeformationofairbubbles.Donotpipet
airbubbles.
MATERIALSREQUIRED,BUTNOTPROVIDED
•Deionizedwater.
•Stem-KitReagents(Ref.IM3630),including7-AADViabilityDye.
•AsanalternativetoStem-CountFluorospheres:Flow-CountFluorospheres(Ref.7547053)
•Icewaterbath.
•Plastictesttubes(12x75mm).
•Calibratedpositivedisplacementpipet(20µL,100µL,2mL)andtipsorcalibratedrepeaterpipet(20µL,100
µL,2mL)andtips.
•Calibratedstandardpipets(20µL,100µL,2mL)andtips.
•Vortexmixer.
•Timer.
•Flowcytometer.
•stemCXPSystemSoftwareONLYforautomatedanalysisofStem-TrolControlCellsonFC500ow
cytometersequippedwithCXPSoftware.
PROCEDURE
Forautomaticanalysis,refertothestemCXPSystemGuideprovidedwiththestemCXPSystemSoftwarefor
completeinstructions.
Formanualanalysis,refertotheStem-KitReagentspackageinsertandthefollowingprocedure.

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NOTE:Inordertostandardizetheanalysis,whenreceivingnewStem-KitReagents,andat
dailyintervalsafterwards,runaprocesscheckbystainingStem-TrolControlCellswith
anormalperipheralbloodsamplefromahealthydonor.Furthermore,asStem-Trol
ControlCellsarestabilizedcells(i.e.nonviablecells),7-AADViabilityDyestainingmay
bevisuallycheckedonStem-TrolControlCells(seetheheading:HistogramCreation).
Ensurethattheowcytometerisproperlyalignedandstandardizedforuorescenceintensityaccordingtothe
manufacturerandlaboratoryguidelines.Ensurethatuorescencecompensationsettingsareproperlyadjusted
accordingtothemanufacturerandlaboratoryguidelines.
Bringthecontrolreagentandantibodiestoroomtemperature.
Foreachexperiment,labelonetube:TROL45/34/7-AAD.
1.Pipet20µLofCD45-FITC/CD34-PEintothetube.
2.Pipet20µLof7-AADViabilityDyeintothetube.
IMPORTANT:Riskofincompletelysisifbloodspecimenremainsonthetoporsideofthetesttube.
Usecarewhenpipettingtopreventthebloodfromtouchingthetoporsideofthetest
tube.Cleanthetubewithacottonswab,ifnecessary,toremovealltracesofblood
specimenfromthetoporsideofthetesttube.
3.Intothebottomofthetube,accuratelypipet100µLofawell-mixednormalwholebloodsampleusinga
calibratedpositivedisplacementorrepeaterpipet.
4.PrepareandaddStem-Trol:
•VortexStem-TrolControlCellsfor5seconds.
•Accuratelypipet20µLofStem-TrolControlCellsintothetube.
•Vortextubesfor5seconds.
5.Incubateatroomtemperature(18–25°C)for20minutes,protectedfromlight.
6.Add2mLofprepared1XNH4ClLysingSolutionintotubeandvorteximmediatelyfor5seconds.
FordetailsonpreparingtheLysingSolution,refertotheStem-KitReagentspackageinsert.
7.Incubateatroomtemperaturefor10minutes,protectedfromlight.
8.Storethetubesinarackplacedonice(2–8°C),andprotectedfromlight.
IMPORTANT:Riskoferroneousresultsifairbubblesarepipetted.ExcessivemixingofStem-Count
orFlow-CountFluorospherescancreateairbubbles.Donotexcessivelymixthe
Stem-CountorFlow-CountFluorospheres,anddonotpipetteairbubblesintothe
sampletubes.
9.GentlymixtheStem-CountorFlow-CountFluorospheresbyinvertingthevial3to5timesbeforeusing.Avoid
excessivemixingtominimizeairbubbleformation.
10.Priortoacquisition,pipette100µLofStem-CountorFlow-CountFluorospheresintothetube.
11.Vortexfor5secondsimmediatelyaftereachaddition.Storeat2–8°C.Repeatvortexingimmediatelypriorto
owcytometricacquisition.
IMPORTANT:Riskoferroneousresultsifsampleisanalyzedmorethan1hourafteradding
Stem-CountorFlow-CountFluorospheres.Preparedsamplesmustbeanalyzedwithin1
hourofaddingStem-CountorFlow-CountFluorospheres.
PreparationSummary(TubeLabel:TROL45/34/7-AAD)
Reagents&SamplesVolume
CD45-FITC/CD34-PE20µL
7-AADViabilityDye20µL
WholeBlood100µL
Stem-TrolControlCells20µL
Vortex–Incubateatroomtemperaturefor20minutes.Protectfromlight

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Reagents&SamplesVolume
1XNH4ClLysingSolution2mL
Vortex–Incubateatroomtemperaturefor10minutes.Protectfromlight
Stem-CountFluorospheres100µL
MANUALGATINGANDANALYSISMETHOD
ProtocolSetup
TheowcytometermustbeequippedtodetectForwardScatter,SideScatterandfouruorescencechannels.For
theFL3channel(forStem-CountorFlow-CountFluorospheresmonitoring)usea620nmbandpasslter.Forthe
FL4channel(for7-AADViabilityDyemonitoring)usea675nmlongpasslter.
NOTE:Thesamegatingschemeandseriesof8histogramsasstatedforspecimenanalysis,
mustbefollowedforStem-TrolControlCells.AsStem-TrolControlCellshavesize
characteristicscloseto,andexpressCD45andCD34antigensatdensitiesthat
approximate,normalimmaturehematopoieticcells,thereisnoneedtomodifytheregion
boundariesalongtheForwardScatter,Fluorescence1andFluorescence2channels.
HoweverasStem-TrolControlCellsSideScattercharacteristicsareuniqueyoumay
adjusttheregionboundariesalongtheSideScatter.RegionsA,B,C,andD(seethe
headingRegionCreationforregiondenition)mustbemodiedtoincludetheStem-Trol
ControlCellscharacteristiccluster.
HistogramCreation
Createhistogramsasfollows:
1.CreateHistogram1asFL1CD45-FITCvsSideScatter.
2.CreateHistogram2asFL2CD34-PEvsSideScatter.
3.CreateHistogram3asFL1CD45-FITCvsSideScatter.
4.CreateHistogram4asForwardScattervsSideScatter.
5.CreateHistogram5asFL1CD45-FITCvsFL2CD34-PE.
6.CreateHistogram6asForwardScattervsSideScatter.
7.CreateHistogram7asTimevsFL3Stem-CountorFlow-CountFluorospheres.
8.CreateHistogram8asFL47-AADvsSideScatter.
Histograms1to4areintendedtocharacterizeCD34+HPC,aprocessthatmaybedelayeduntiltheanalysisstep.
TheserstfourhistogramsaresetupaccordingtotheISHAGEGuidelinesforCD34+CellDeterminationbyFlow
Cytometry(2,3).
Histograms5to7areintendedtomonitorparametersthatareofimportanceduringtheacquisitionstep.These
includetheForwardScatterdiscriminator,thenumberofCD45+eventstobecollectedandthecorrectuorosphere
singletsaccumulation.
Histogram8isintendedtodiscriminateandanalyzeviableeventsfromnonviableeventswhenrequired.
RegionCreation
Createregionsasfollows:
1.Histogram1–CreatearectilinearRegionAtoincludeallCD45+leukocytesandeliminateplatelets,redblood
celldebris,andaggregates.
2.Histogram1–CreateanamorphousRegionEonthelymphocytes(brightCD45,lowsidescatter).
3.Histogram2–CreatearectilinearRegionBonHistogram2toincludeallCD34+eventswithlowtointermediate
SideScatter.Setastopcountof75,000events(CD45+events)inHistogram2.
4.Histogram3–CreateanamorphousRegionConHistogram3toincludeallclusteredCD45dimevents.
5.Histogram4–CreateanamorphousRegionDonHistogram4toincludeallclusteredeventswithintermediate
sidescatterandintermediatetohighforwardscatter.
6.Histogram5–CreateaQuadstatRegionIonHistogram5toverifythelowerlimitofCD45expressionon
CD34+events.

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7.Histogram5–CreateanamorphousRegionHonHistogram5tosurroundallStem-CountorFlow-Count
Fluorospheres,includingdoublets.TheregionHshouldbelocatedatthetoprightcorneroftheHistogram5.
NOTE:BesurethatRegionHisdrawnasanAMORPHOUSregion.
8.Histogram6–CopyRegionDfromHistogram4asRegionFinHistogram6.
9.Histogram7–CreatearectilinearRegionGonHistogram7toincludetheStem-CountorFlow-Count
Fluorospheressingletsonly.RegionGcanbelabelledas“CAL”toallowautomaticcalculationofabsolute
numbersofCD34+HPC(refertotheinstrumentmanualforfurtherdetails).
10.Histogram8–CreatearectilinearRegionJonHistogram8toseparateviableleukocytes(7-AADnegative
events)fromnonviableevents(mainlyStem-TrolControlCellspositivefor7-AADstaining).
GateCreation
Creategatesasfollows:
1.Histogram1–Assign“H”toHistogram1todisplayalleventsexcludingallStem-CountorFlow-Count
Fluorospheres.Refertotheinstrumentmanualforthecreationof“notgates.”
2.Histogram2–Assign“A”toHistogram2todisplayallCD45+events.
3.Histogram3–Assign“A”and“B”(AB)toHistogram3todisplayallCD45+CD34+events.
4.Histogram4–Assign“A”and“B”and“C”(ABC)toHistogram4todisplayallCD45+CD34+eventsclustered
eventswithlowtointermediatesidescatterandlowCD45stainingexpression.EventsfromRegionABCD
arerealCD34+HPC.
5.Histogram5–Ungatedtodisplayallevents.
6.Histogram6–Assign“E”todisplaylymphocytesasavisualcheckonthediscriminator.
7.Histogram7–Assign“H”tohistogram7todisplayallStem-CountorFlow-CountFluorospheres,including
doublets.
8.Histogram8–Assign“A”tohistogram8todisplayCD45+events.
FlowCytometerSetting
1.Ensurethattheowcytometerisproperlyalignedandstandardizedforlightscatteranduorescenceintensity
accordingtothemanufacturer’sandlaboratoryguidelines.Verifythatcolorcompensationissetforstandard
operation.Refertotheinstrument’smanualforfurtherinstructions.
2.Vortextesttubesfor5seconds.
3.Performdataacquisitionontheowcytometer.Aminimumof75,000CD45+eventsmustbeanalyzed.
4.AdjustthediscriminatorandregionsbyanalyzingtheTROL45/34/7-AADtube.
AnalysisExample
ThehistogramsshownintheAPPENDIXaredisplayedinanascendingnumberorderasdisplayedontheprotocol.
CalculationofCD34+Stem-TrolControlCells
UsingowcytometricresultsautomaticallyadjustedwiththeStem-CountorFlow-CountFluorospheresAssayed
ConcentrationobtainedusingSystemIISoftware(Version3.0)andaCOULTEREPICSXL/XLMCLowcytometer.
InordertoobtainautomaticallycalculatedabsolutecountdeterminationsonCOULTEREPICSXL/XL-MCLow
cytometers,thecorrectStem-CountorFlow-CountFluorospheresAssayedConcentrationmustbeenteredbefore
sampleacquisition.
Enter"CAL"astheNameoftheStem-CountorFlow-CountFluorospheressingletsRegionG,andenterthe
value,forexample,1,000intotheCALFACTORboxontheSTATISTICSdialogscreenoftheSET-UPSCREEN
PROTOCOLmenu.
EnteringtheCALFactorforStem-CountorFlow-CountFluorospheres:
1.AttheAcquisitionRunscreen,selectSetupScreen>>Protocol.
2.SelectStatistics>>CALFACTOR.
3.EntertheCALfactornumber(assayedconcentration)fromtheStem-CountorFlow-CountFluorospheresvial.
4.PressENTER.
5.SelectOKAY.
6.Attheprompt,typeYforyes.

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Whenatleast1,000uorospheressingletsareacquired,theabsolutecountfortheCD34+Stem-TrolControlCells
isautomaticallyadjustedandcanbetakendirectlyfromRegionDstatisticsprintoutresults.
Table(below):
ExampleofstatisticsobtainedwithtubeTROL45/34/7-AADonSystemIISoftware,usingtheCALFACTOR
function,where:
•1,024istheStem-CountFluorospheresAssayedConcentration.
•5,248isthetotalnumberofuorospheresaccumulatedintheCALregionduringthefullacquisitiontime.
Inthisexample,allcountsareadjustedby:1,024/5,248.
Stats:Not
NormalizedHistListgating:Disabled
RegionIDCountsAdjusted
(Cells/µL)
1ALEUKS9,798
2BCD34POS279
3CCD45DIM264
4DStem-TrolControl
Cells
248
7GCAL1,0241,024
5HAllStem-Count
Fluorospheres
1,046
1.Recordtheadjustedabsolutecounts(cells/µL)inRegionsDfromTubesTROL45/34/7-AAD.
.
Example:
.
TubeTROL45/34/7-AAD:Stem-TrolControlCells=248cells/µL.
2.Multiplythisprecisecountbythenormalizationfactor(N)=5.
.
NOTE:
.
ItisnecessarytonormalizetheabsolutecountofStem-TrolControlCellswithregardtotheaddedvolumesduringthetest:
DetermineNbydividingthevolumeofthecountingreference(Stem-CountFluorospheressinglets),bythevolumeof
Stem-TrolControlCellsaddedtothetesttube.
.
.
.
Example:
.
100µLStem-CountFluorospheresareaddedto20µLofStem-TrolControlCells:
.
N=100÷20=5
.
NormalizedStem-TrolControlCellsabsolutecount=248x5=1,240cells/µL.
3.VerifytheStem-TrolControlCellsabsolutecountobtainedbycomparingittotheStem-TrolControlCells.
AssayedConcentration(cells/µL)statedontheviallabel.TheStem-TrolControlCellsabsolutecountobtained
mustbewithin±15%oftheStem-TrolControlCellsAssayedConcentration.Thestainingmethodandlysing
processarenowvalidated.
.
Example:
.
Stem-TrolControlCellsAssayedConcentration=1,380cells/µL.
.
Rangeofacceptedvalues:1,173–1,587(1,380±207)cells/µL
.
Thenormalizedabsolutecount=1,240cells/µLiswithintherange.
.
.
.
IMPORTANT:
.
IftheStem-TrolControlCellsabsolutecountfallsoutsideoftherangeofacceptedvalues,determinewhetherthe
pipettinghasbeencorrectlyperformed,especiallyfortheStem-CountorFlow-CountFluorospheresandStem-Trol
ControlCells.Visuallychecktheowcytometerreportsandthequalityofstainingandlysingprocessinyourtesttubes.
Verifythewaytheregionboundarieswereset.Ifnecessary,repeatthepreparationwithnewtesttubes.Acquireand
analyzeboththenewandthepreviousseriesoftubes.Comparethetworesults.Ifthereisnoagreement,callyourlocal
BeckmanCoulterRepresentative.

B60231–AE8of128
TRADEMARKS
BeckmanCoulter,thestylizedlogo,andtheBeckmanCoulterproductandservicemarksmentionedhereinare
trademarksorregisteredtrademarksofBeckmanCoulter,Inc.intheUnitedStatesandothercountries.
ADDITIONALINFORMATION
www.beckmancoulter.com
SymbolsKey
GlossaryofSymbolsisavailableatbeckman.com/techdocs(documentnumberB60062)

B60231–AE9of128
CellulesdecontrôleStem-Trol
IM3632
Réservéauxdosagesdiagnostiquesinvitro
UTILISATION
Stem-TrolControlCellsestunproduitdecontrôledequalitédosépourl’analysedel’immunophénotypageutilisant
desréactifsauxanticorpsmonoclonauxCD45et/ouCD34etlacytométrieenux.Ilfournituncontrôlecellulaire
positifquiesttraitédelamêmemanièrequ’unéchantillondesanglorsquelesStem-TrolControlCellssontinjectées
dansunéchantillondesangtotalpériphérique.Celapermetdevérierl’efcacitéduréactifetdesméthodes
utiliséespourlacolorationdescellulescibles(c.-à-d.CD34+celluleshématopoïétiquesprogénitricesHPC),la
lyseérythrocytaireetl’analysedeséchantillonsparcytométrieenux.
SeréféreràlanoticedesStem-KitReagents(REFIM3630)pourlesinstructionscomplètesencasd’analyse
manuelle.Référez-vousaustemCXPSystemGuide(GuidedusystèmestemCXP)fourniaveclelogicielsystème
stemCXPpourconsulterlesinstructionscomplètessivousutilisezlaméthoded’analyseautomatisée.
RÉSUMÉ
L’immunophénotypageparcytométrieenuxpermetl’identicationetledénombrementdecellulesciblesdans
deséchantillonsbiologiques.Leséchantillonsintéressantssontcolorésavecdesanticorpsmonoclonauxetles
érythrocytessontlysésavantdeprocéderàl’analysecytométriqueenux.Uncontrôlecellulairepositifestrequis
pourvérierl’efcacitéduréactif,lesméthodesdepréparationdel’échantillonetlesprocéduresdecoloration
(1).Uncontrôlecellulairepositifdoitimiterunecelluleciblereprésentativeentermesd’efcacitédel’anticorps
monoclonal,delyseérythrocytaireetd’analysecytométriqueenux.
Stem-TrolControlCellsestunepréparationliquidedecellulesdérivéesdeKG-1astabiliséesayantl’antigène
d’expressionetlespropriétéscolorantesdeCD45etCD34représentativesdecellestrouvéesdansCD34+HPC.
PRINCIPE
LesStem-TrolControlCellssontdescellulesKG-1apréservéesquiontétémodiéesetstabiliséespourexprimer
lesépitopesdeclasseIIICD34(2)etl’antigèneleucocytairecommunCD45àdesdensitésprochesdecellesdes
celluleshématopoïétiqueshumainesimmaturesnormales.UnmélangedeStem-TrolControlCellsinoculédansdu
sangfraistotalnormalestd’abordcoloréparlesréactifsd’anticorpsmonoclonaletlemarqueurdeviabilité7-AAD
ViabilityDyepuislysépourretirerlesérythrocytes.LesStem-CountouFlow-CountFluorospheressontajoutés
pourdéterminerdirectementlesvaleursabsolues.L’analysecytométriqueenuxdelapréparationcoloréeet
lyséedéterminelavaleurabsoluedescellulescibles.Lesrésultatsattendussontdéterminésàl’aidedesStem-Kit
ReagentssurlessystèmesdecytomètresenuxFC500validésetstandardisés,équipésdulogicielsystème
CXP(Version2.0)conçuspouranalyserdeséchantillons.
RÉACTIFS
LesStem-TrolControlCellssontensuspensiondansunesolutionisotoniquecontenantdesstabilisantsetduBSA.
Laconcentrationcellulaire(cellules/µL)estdérivéedesanalysesrépétéesàdemultiplesreprisesenutilisantla
méthodederéférence.Lavaleurspéciqueguresurl’étiquetteduacon.
AVERTISSEMENTSETPRÉCAUTIONS
1.Lesspécimens,leséchantillonsettouslesobjetsentrantencontactaveccesderniersdoiventêtretraités
commeétantpotentiellementinfectieuxetdoiventêtreéliminésenrespectantlesconsignesdesécurité
appropriées.
2.Nejamaispipeteràlaboucheetéviterlecontactdeséchantillonsoudesréactifsaveclapeauetles
muqueuses.
3.Nepasutiliserleréactifau-delàdeladatedepéremptiongurantsurl’étiquetteduacon.
4.Nepascongelerlesréactifs.
5.Nepassoumettrelesréactifsàlachaleurpendantlaconservationoul’utilisation.
6.éviterl’évaporationoulafuitederéactifsenrebouchantcorrectementlesaconsaprèsutilisationoudes
résultatserronéspeuventapparaître.
7.LesStem-TrolControlCellssedéposentlorsdepériodesprolongées.Assurez-vousdebienremettreles
cellulesensuspensionavantdelesutiliser.Évitezdemélangerdemanièreexcessiveandeminimiserla
formationdebullesd’air.Nepipetezpasdebullesd’air,aurisqued’obtenirdesrésultatserronés.

B60231–AE10of128
8.Utiliserunepipettejaugéepréalablementouunepipetteàrépétitionpourdélivrerleséchantillonsetles
Stem-TrolControlCells,aurisqued’obtenirdesrésultatserronésdanslecascontraire.
9.Respecterlestechniquesdepipetagerecommandéesparlefabricantdespipettespourassurerunpipetage
précisetexactdeséchantillonsetdesStem-TrolControlCells,aurisqued’obtenirdesrésultatserronésdans
lecascontraire.
10.ChaquelotdeStem-TrolControlCellsauneconcentrationencellulesspécique.Assurez-vousd’utiliserla
bonneconcentrationlorsquevousdéterminezlesvaleursabsolues.
11.Destempsd'incubationoudemélangeoudestempératuresdifférentsdeceuxindiquéspeuventdonnerdes
résultatserronés.
12.Lesrésultatspeuventêtreerronéssilecytomètreenuxn'estpascorrectementalignéoucalibrépourla
uorescenceousilefenêtragedespopulationsdecellulesestmalréglé.
13.Lesrésultatsdéterminésenutilisantdescytomètresenux,dessystèmesdelyseoudesanticorpsdifférents
deceuxutiliséspourdéterminerlesrésultatsattenduspeuventnepastomberdanslesfourchettesdevaleurs
attendues.
14.Respectezlesbonnespratiquesdelaboratoire(BPL)lorsdel’utilisationdeceréactif.
CLASSIFICATIONDESRISQUESSGH
Nonclassiécommedangereux
Lachetechniquesanté-sécurité
estdisponibleàl’adresse
techdocs.beckman.com
CONSERVATION,STABILITÉETÉLIMINATION
•Stabilitéduréactif:ceréactifeststablejusqu’àladated’expirationindiquéesurl’étiquetteduaconlorsqu’il
estconservé,sansêtreouvert,àunetempératurecompriseentre2–8°C.Nepasutiliseraprèsladate
d’expiration.Lastabilitéd’unaconentaméestde30jours.
Lesaconsouvertsdoiventêtrehermétiquementrebouchésetconservésàunetempératurecompriseentre
2–8°Caprèsutilisation.Nepaslescongeler.
•AmenerlesStem-TrolControlCellsàlatempératureambiante(18–25°C)avantutilisation.
IMPORTANT:RisquederésultatserronésencasdefuitedesStem-TrolControlCells.Unefoisouvert,
leacondeStem-TrolControlCellsdoitêtrerangéenpositionverticalepourévitertout
risquedefuite.Nepasutiliserlesréactifssidessignesdefuitesontvisibles.
Signesdedétérioration
L’incapacitéàobtenirlesrésultatsescomptésouundécalagedeladiffusiondelalumièreoudespropriétésde
uorescencepeuventindiquerqueleproduitestdétérioré.Lacalibrationdel’instrument,lapréparationtechnique
del’échantillonetlaperformancedel’anticorpsdoiventégalementêtrevériées.
Toutchangementd’aspectphysiquedesStem-TrolControlCells(leuraspectnormalestunliquideincolore)
outoutevariationmajeure(>variationde15%delavaleurabsolue)desvaleursobtenuesparl’analysedela
cytométrieenuxlorsdelarépétitiondestestspeutindiquerunedétérioration,parconséquent,leréactifnedoit
plusêtreutilisé.
Préparationduréactif
Stem-TrolControlCellsestunesuspensioncellulaireprêteàl’emploi.Unmélangeadéquat(agiterauvortex
pendant10–12secondes)estnécessaireavantchaquepremierpipetageduacon.Évitezdemélangerdemanière
excessiveandeminimiserlaformationdebullesd’air.Nepipetezpasdebullesd’air.
MATÉRIELREQUISMAISNONFOURNI
•Eaudéionisée.
•Stem-KitReagents(REFIM3630)avecmarqueurdeviabilité7-AADViabilityDye.
•AlternativeauxStem-CountFluorospheres:Flow-CountFluorospheres(REF7547053)
•Baind’eauglacée.
•Tubesàhémolyseenplastique(12x75mm).
•Pipettejaugéespréalablement(20µL,100µL,2mL)etemboutsoupipetteàrépétitioncalibrée(20µL,
100µL,2mL)etembouts.

B60231–AE11of128
•Pipettescalibréesstandard(20µL,100µL,2mL)etembouts.
•Agitateurvortex.
•Chronomètre.
•Cytomètreenux.
•LogicielsystèmestemCXPUNIQUEMENTpourl’analyseautomatiséedeStem-TrolControlCellssur
cytomètresenuxFC500équipésdulogicielCXP .
PROCÉDURE
Pourlesanalysesautomatisées,référez-vousaustemCXPSystemGuide(GuidedusystèmestemCXP)fourni
aveclelogicielsystèmestemCXPpourconsulterlesinstructionscomplètes.
Pourl’analysemanuelle,seréféreràlanoticedesStem-KitReagentsetàlaprocéduresuivante.
REMARQUE:Andecalibrerl’analyse,lorsdelaréceptiondenouveauxStem-KitReagents,puisà
intervallesquotidiensparlasuite,effectuerunevéricationduprocessusencolorantdes
Stem-TrolControlCellsàl’aided’unéchantillondesangpériphériquenormalprovenant
d’undonneursain.Deplus,lesStem-TrolControlCellsétantstabilisées(c.-à-d.qu’il
s’agitdecellulesnonviables),lacolorationparlemarqueurdeviabilité7-AADViability
DyepeutêtrevériéevisuellementsurlesStem-TrolControlCells(cf.larubrique:
Créationd’histogramme).
S’assurerquelecytomètreenuxestcorrectementalignéetcalibrépourlesintensitésdeuorescenceselonles
recommandationsdufabricantetdulaboratoire.S’assurerqueleréglagedelacompensationdeuorescenceest
correctementdéniselonlesrecommandationsdufabricantetdulaboratoire.
Amenerleréactifdecontrôleetlesanticorpsàlatempératureambiante.
Pourchaqueessai,étiquettesurletubed’échantillon:TROL45/34/7-AAD.
1.Pipeter20µLdeCD45-FITC/CD34-PEdansletube.
2.Pipeter20µLdemarqueurdeviabilité7-AADViabilityDyedansletube.
IMPORTANT:Risquedelyseincomplèteencasderésidusd’échantillondesangsurlapartie
supérieureoulatéraledutubeàessai.Pipetersoigneusementpouréviterquelesang
n’entreencontactaveclapartiesupérieureoulatéraledutubeàessai.Nettoyerletube
d’échantillonavecuncoton-tigesinécessaire,and’enlevertoutetracedel’échantillon
desangsurlapartiesupérieureoulatéraledutubeàessai.
3.Danslefonddutubed’échantillon,pipeterprécisément100µLd’unéchantillondesangtotalnormal
correctementmélangéàl’aided’unepipettejaugéepréalablementoud’unepipetteàrépétition.
4.PrépareretajouterleStem-Trol:
•AgiterauvortexlesStem-TrolControlCellspendant5secondes.
•Pipeterprécisément20µLdeStem-TrolControlCellsdansletubed’échantillon.
•Agiterlestubesauvortexpendant5secondes.
5.Incuberàtempératureambiante(18–25°C)pendant20minutes,àl’abridelalumière.
6.Ajouter2mLde1XNH4ClLysingSolutionpréparéedansletubed’échantillonetagiterimmédiatementau
vortexpendant5secondes.
Pourdavantagededétailssurlapréparationdelasolutiondelyse,seréféreràlanoticedesStem-Kit
Reagents.
7.Incuberàtempératureambiantependant10minutes,àl’abridelalumière.
8.Conserverlestubesd’échantillonsurunsupportplacédanslaglace(2–8°C)etàl’abridelalumière.
IMPORTANT:Risquederésultatserronéssidesbullesd’airsontpipetées.MélangerlesStem-Count
ouFlow-CountFluorospheresdemanièreexcessivepeutentraînerlaformationde
bullesd’air.ÉvitezdemélangerlesStem-CountouFlow-CountFluorospheresde
manièreexcessiveetnepipetezpasdebullesd’airdanslestubesd’échantillon.
9.MélangerdoucementlesStem-CountouFlow-CountFluorospheresenretournantleacon3à5foisavant
l’utilisation.Évitezdemélangerdemanièreexcessiveandeminimiserlaformationdebullesd’air.

B60231–AE12of128
10.Avantl’acquisition,pipeter100µLdeStem-CountouFlow-CountFluorospheresdansletubed’échantillon.
11.Agiterauvortexpendant5secondesimmédiatementaprèschaqueaddition.Conserveràunetempérature
compriseentre2–8°C.Agiterànouveauauvorteximmédiatementavantl’acquisitionparcytométrieenux.
IMPORTANT:Risquederésultatserronéssil’échantillonestanalyséplusd’uneheureaprèsl’addition
desStem-CountouFlow-CountFluorospheres.Leséchantillonspréparésdoiventêtre
analysésdansl’heurequisuitl’additiondesStem-CountouFlow-CountFluorospheres.
Résumédelapréparation(étiquettedutubed’échantillon:TROL45/34/7-AAD)
RéactifsetéchantillonsVolume
CD45-FITC/CD34-PE20µL
Colorantviabilité7-aminoactinomycine20µL
Sangtotal100µL
Stem-TrolControlCells20µL
Agiterauvortex–Laisserincuberàtempératureambiantependant20minutes.
Conserveràl’abridelalumière
1XNH4ClLysingSolution2mL
Agiterauvortex–Laisserincuberàtempératureambiantependant10minutes.
Conserveràl’abridelalumière
Stem-CountFluorospheres100µL
CONFIGURATIONMANUELLEETMÉTHODED’ANALYSE
Congurationduprotocole
LecytomètreenuxdoitêtreéquipépourdétecterleForwardScatter(diffusionavant),leSideScatter(diffusion
latérale)etlesquatrecanauxdeuorescence.PourlecanalFL3(pourlasurveillancedesStem-Countou
Flow-CountFluorospheres)utiliserunltrepasse-bandede620nm.PourlecanalFL4(pourlasurveillancedu
marqueurdeviabilité7-AADViabilityDye)utiliserunltrepasse-longde675nm.
REMARQUE:Lemêmeschémadecongurationavecdessériesde8histogrammesdoitêtrerespecté
pourlesStem-TrolControlCells,telqu’indiquépourl’analysed’échantillon.Commeles
Stem-TrolControlCellsontunetailleprocheetexprimentlesantigènesCD45etCD34
àdesdensitésprochesdecellesdescelluleshématopoïétiqueimmaturesnormales,
iln’estpasnécessairedemodierleslimitesderégionlelongduForwardScatter
(diffusionavant)etdescanauxFluorescence1etFluorescence2.Cependant,comme
lescaractéristiquesdeSideScatter(diffusionlatérale)desStem-TrolControlCellssont
uniques,ilestpossibled’ajusterleslimitesderégionlelongduSideScatter(diffusion
latérale).LesrégionsA,B,CetD(cf.larubriqueCréationderégionpourladénition
desrégions)doiventêtremodiéespourinclurelescaractéristiquesdugroupedes
Stem-TrolControlCells.
CréationdesHistogrammes:
Créerleshistogrammesdelamanièresuivante:
1.Créerl’Histogramme1enplaçantleFL1CD45-FITCvsleSideScatter(diffusionlatérale).
2.Créerl’Histogramme2enplaçantleFL2CD34-PEvsleSideScatter(diffusionlatérale).
3.Créerl’Histogramme3enplaçantleFL1CD45-FITCvsleSideScatter(diffusionlatérale).
4.Créerl’Histogramme4enplaçantleForwardScatter(diffusionavant)vsleSideScatter(diffusionlatérale).
5.Créerl’Histogramme5enplaçantleFL1CD45-FITCvsleFL2CD34-PE.
6.Créerl’Histogramme6enplaçantleForwardScatter(diffusionavant)vsleSideScatter(diffusionlatérale).
7.Créerl’Histogramme7enplaçantTimevslesFL3Stem-CountouFlow-CountFluorospheres.
8.Créerl’Histogramme8enplaçantleFL47-AADvsleSideScatter(diffusionlatérale).
LesHistogrammes1à4sontdestinésàcaractériserCD34+HPC,unprocessusquipeutêtreretardéjusqu’àl’étape
del’analyse.CesquatrepremiershistogrammessontcongurésconformémentauxrecommandationsISHAGE
pourCD34+déterminationcellulairedelacytométrieenux(2,3).

B60231–AE13of128
LesHistogrammes5à7sontdestinésàsurveillerlesparamètresimportantspendantl’étaped’acquisition.Ces
dernierscomprennentlediscriminateurduForwardScatter(diffusionavant),lenombred’événementsCD45+à
recueilliretl’accumulationcorrectedesinguletsuorosphères.
L’Histogramme8estdestinéàdiscrimineretanalyserlesévénementsviablesdesévénementsnonviablesencas
debesoin.
CréationdesRégions
Créerlesrégionsdelamanièresuivante:
1.Histogramme1–CréerunerégionrectilinéaireApourincluretouslesCD45+leucocytesetéliminerles
plaquettes,lesdébrisdeshématiesetlesagrégats.
2.Histogramme1–CréerunerégionamorpheEsurleslymphocytes(CD45brillant,SideScatter(diffusion
latérale)bas).
3.Histogramme2–CréerunerégionrectilinéaireBsurl’Histogramme2pourincluretousles
événementsCD34+avecunSideScatter(diffusionlatérale)faibleàintermédiaire.Dénirunarrêtà
75000événements(événementsCD45+)dansl’Histogramme2.
4.Histogramme3–CréerunerégionamorpheCsurl’Histogramme3pourincluretouslesévénementsCD45faibles
regroupés.
5.Histogramme4–CréerunerégionamorpheDsurl’Histogramme4pourincluretouslesévénements
regroupésavecunSideScatter(diffusionlatérale)intermédiaireetunForwardScatter(diffusionavant)
intermédiaireàélevé.
6.Histogramme5–CréerunerégionquadstatIdansl’Histogramme5pourvérierlalimiteinférieurede
l’expressiondeCD45surlesévénementsCD34+.
7.Histogramme5–CréerunerégionamorpheHsurl’Histogramme5pourencerclertouslesStem-Countou
Flow-CountFluorospheres,ycomprislesdoublets.LarégionHdoitsesituerdanslecoinsupérieurdroitde
l’Histogramme5.
REMARQUE:s’assurerquelarégionHestdessinéecommeunerégionAMORPHOUS(AMORPHE).
8.Histogramme6–CopierlarégionDdel’Histogramme4entantquerégionFdel’Histogramme6.
9.Histogramme7–CréerunerégionrectilinéaireGsurl’Histogramme7pourengloberuniquementlessingulets
Stem-CountouFlow-CountFluorospheres.LarégionGpeutêtreétiquetée«CAL»pourpermettrelecalcul
automatiquedesnombresabsolusdeCD34+HPC(seréféreraumanueldel’instrumentpourplusdedétails).
10.Histogramme8–CréerunerégionrectilinéaireJsurl’Histogramme8pourséparerlesleucocytesviables
(événementsnégatifs7-AAD)desévénementsnonviables(principalementlesStem-TrolControlCells
positivesàlacoloration7-AAD).
CréationdesFenêtresd'Analyse
Créerlescontrôlesdelamanièresuivante:
1.Histogramme1–Attribuer«H»àl’Histogramme1pourafchertouslesévénementsexcluanttousles
Stem-CountouFlow-CountFluorospheres.Seréféreraumanueldel’instrumentpourlacréation«notgates»
(sanslimites).”
2.Histogramme2–Attribuer«A»àl’Histogramme2pourafchertouslesévénementsCD45+.
3.Histogramme3–Attribuer«A»et«B»(AB)àl’Histogramme3pourafchertouslesévénementsCD45+
CD34+.
4.Histogramme4–Attribuer«A»et«B»et«C»(ABC)àl’Histogramme4pourafchertouslesévénements
CD45+CD34+etlesévénementsregroupésavecunSideScatter(diffusionlatérale)faibleàintermédiaireet
uneexpressiondecolorationCD45faible.LesévénementsdelarégionABCDsontréellementCD34+HPC.
5.Histogramme5–Nonfenêtrépourvisualisertouslesévénements.
6.Histogramme6–Attribuer«E»pourafcherleslymphocytesentantquecontrôlevisuelsurlediscriminateur.
7.Histogramme7–Attribuer«H»àl’Histogramme7pourafchertouslesStem-CountouFlow-Count
Fluorospheres,ycomprislesdoublets.
8.Histogramme8–Attribuer«A»àl’Histogramme8pourafchertouslesévénementsCD45+.

B60231–AE14of128
Réglageducytomètreenux
1.S’assurerquelecytomètreenuxestcorrectementalignéetcalibrépourladiffusiondelalumièreetl’intensité
deuorescenceselonlesrecommandationsdufabricantetdulaboratoire.Vérierquelacompensationde
couleurestrégléesurlefonctionnementstandard.Seréféreraumanueldel’instrumentpourdavantage
d’instructions.
2.Agiterauvotexletubeàessaipendant5secondes.
3.Exécuterl’acquisitiondedonnéessurlecytomètreenux.Aumoins75000événementsCD45+doiventêtre
analysés.
4.Ajusterlediscriminateuretlesrégionsenanalysantletubed’échantillonTROL45/34/7-AAD.
Exempled'Analyse
LeshistogrammesprésentésenANNEXEsontafchésparordrecroissant,commedansleprotocole.
CalculdeCD34+Stem-TrolControlCells
EnutilisantlesrésultatsdelacytométrieenuxautomatiquementajustésaveclesStem-CountouFlow-Count
Fluorospheresdelaconcentrationobtenueàl’aidedulogicielSystemII(Version3.0)etuncytomètreenux
COULTEREPICSXL/XLMCL.
And’obtenirlesdéterminationsdevaleursabsoluescalculéesautomatiquementsurlescytomètresenux
COULTEREPICSXL/XL-MCL,laconcentrationexacteenStem-CountouFlow-CountFluorospheresdoitêtre
saisieavantl’acquisitiondel’échantillon.
Saisir«CAL»entantquenomdessinguletsStem-CountouFlow-CountFluorospheresdelarégionG,puis
saisirlavaleur,parexemple,1000danslazoneCALFACTOR(facteurcal)surl’écrandedialogueSTATISTICS
(statistiques)dumenuSET-UPSCREENPROTOCOL(écrandecongurationduprotocole).
EntrerleCALFactor(facteurCAL)pourlesStem-CountouFlow-CountFluorospheres:
1.Surl’écranAcquisitionRun(exécutiondel’acquisition),sélectionnerSetupScreen>>Protocol(écrande
congurationduprotocole).
2.Sélectionnerlesstatistiques>>CALFACTOR(facteurCAL).
3.SaisirlenumérodefacteurCAL(concentration)gurantsurleacondeStem-CountouFlow-Count
Fluorospheres.
4.AppuyersurENTER(ENTRÉE).
5.SélectionnerOKAY(OK).
6.Àl’invite,taperYpouryes(oui).
Lorsqu’aumoins1000singuletsuorosphèressontacquis,lavaleurabsoluedeCD34+Stem-TrolControlCells
estautomatiquementajustéeetpeutêtreprisedirectementdepuislesstatistiquesdesrésultatsd’impressionde
larégionD.
Tableau(ci-dessous):
Exempledestatistiquesobtenuesavecletubed’échantillonTROL45/34/7-AADetlelogicielSystemIIenutilisant
lafonctionCALFACTOR(facteurCAL):
•1024estlaconcentrationenStem-CountFluorospheres.
•5248estlenombretotaldeuorosphèresaccumuléesdanslarégionCALpendanttouteladurée
d’acquisition.
Danscetexemple,touteslesvaleurssontajustéesdelamanièresuivante:1024/5248.
Stats:Hist.non
normaliséLimitationdes
listes:régionID
désactivée
Valeursajustées
(cellules/µL)
1ALEUKS9798
2BCD34POS279
3CCD45DIM264
4DStem-TrolControl
Cells
248

B60231–AE15of128
Stats:Hist.non
normaliséLimitationdes
listes:régionID
désactivée
Valeursajustées
(cellules/µL)
7GCAL10241024
5HTouslesStem-Count
Fluorospheres
1046
1.Enregistrerlesvaleursabsoluesajustées(cellules/µL)danslesrégionsDàpartirdestubesd’échantillon
TROL45/34/7-AAD.
.
Exemple:
.
Tubed’échantillonTROL45/34/7-AAD:Stem-TrolControlCells=248cellules/µL.
2.Multipliercettevaleurpréciseparlefacteurdenormalisation(N)=5.
.
REMARQUE:
.
IlestnécessairedenormaliserlavaleurabsoluedesStem-TrolControlCellsenfonctiondesvolumesajoutéspendantle
test:déterminerNendivisantlevolumedunombrederéférence(singuletsStem-CountFluorospheres)parlevolume
deStem-TrolControlCellsajoutédansletubeàessai.
.
.
.
Exemple:
.
100µLdeStem-CountFluorospheressontadditionnéesà20µLdeStem-TrolControlCells:
.
N=100÷20=5
.
ValeurabsoluenormaliséedeStem-TrolControlCells=248x5=1240cellules/µL.
3.VérierlavaleurabsoluedesStem-TrolControlCellsobtenueenlacomparantauxStem-TrolControlCells.
Concentration(cellules/µL)indiquéesurl’étiquetteduacon.LavaleurabsoluedesStem-TrolControlCells
obtenuedoitcorrespondreà±15%delaconcentrationenStem-TrolControlCells.Laméthodedecoloration
etleprocessusdelysesontmaintenantvalidés.
.
Exemple:
.
ConcentrationenStem-TrolControlCells=1380cellules/µL.
.
Plagedevaleursacceptées:1173–1587(1380±207)cellules/µL
.
Lavaleurabsoluenormalisée=1240cellules/µLappartientàlaplage.
.
.
.
IMPORTANT:
.
SilavaleurabsoluedesStem-TrolControlCellsnefaitpaspartiedelaplagedevaleursautorisées,vériersilepipetage
aétéexécutécorrectement,enparticulierencequiconcernelesStem-CountouFlow-CountFluorospheresetles
Stem-TrolControlCells.Effectueruncontrôlevisueldesrapportsducytomètreenuxetdelaqualitédesprocessus
decolorationetdelysedanslestubesàessai.Vérierlamanièredontleslimitesdelarégionontétécongurées.Si
nécessaire,recommencerlapréparationavecdenouveauxtubesàessai.Acquériretanalyseràlafoislesnouvelles
etlesprécédentessériesdetubesd’échantillon.Comparerlesdeuxrésultats.S’ilsneconcordentpas,contacter
lereprésentantlocaldeBeckmanCoulter.
MARQUES
BeckmanCoulter,lelogostyliséetlesmarquesdesproduitsetdesservicesBeckmanCoultermentionnéesici
sontdesmarquesoudesmarquesdéposéesdeBeckmanCoulter,Inc.auxÉtats-Unisetdansd’autrespays.
INFORMATIONSSUPPLÉMENTAIRES
www.beckmancoulter.com
Légendedessymboles
Glossairedessymbolesdisponiblessurlapagebeckman.com/techdocs(documentnuméroB60062)

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Stem-Trol-Kontrollzellen
IM3632
In-vitro-Diagnostikum
VERWENDUNGSZWECK
Stem-TrolControlCellsstelleneinAssay-QualitätskontrollproduktfürdieAnalysezurImmunphänotypisierungmit
CD45-und/oderCD34-monoklonalenAntikörper-ReagenzienundDurchusszytometriedar.Eslieferteinepositive
Zellkontrolle,dieaufgleicheWeisewieeineBlutprobeverarbeitetwird,wobeidieStem-TrolControlCellsineine
vollumfänglicheBlutprobeeingeimpftwerden.DiesermöglichtdieÜberprüfungderReagenzienleistungundderfür
dieEinfärbungderZielzellenverwendetenMethoden(d.h.CD34+HematopoieticProgenitorCells(blutbildende
Stammzellen),HPC),dieLysierungvonErythrozytenunddieAnalysevonProbenmitderDurchusszytometrie.
SiehePackungsbeilagezudenStem-KitReagents(REFIM3630)fürvollständigeAnweisungenzurDurchführung
einermanuellenAnalyse.EinevollständigeAnleitungbeiVerwendungderautomatisiertenAnalyseistimstemCXP
SystemGuide(System-Handbuch)derstemCXP-Systemsoftwareenthalten.
ZUSAMMENFASSUNG
DieAnalysezurImmunphänotypisierungmitderDurchusszytometrieumfasstdieIdentizierungund
AufzählunggezielterZelleninbiologischenProben.DieinteressantenProbenwerdenvorderAnalysemit
demDurchusszytometermitmonoklonalenAntikörpernundErythrozytenlysiert.EinepositiveZellkontrolleist
erforderlich,umdieLeistungdesReagenzes,dieMethodenderProbenvorbereitungunddieEinfärbungsverfahren
zubestätigen(1).EinepositiveZellkontrollemusseinerepräsentativeZielzellehinsichtlichdermonoklonalen
Antikörperleistung,derLysierungderErythrozytenundderAnalysemitdemDurchusszytometerimitieren.
Stem-TrolControlCellssindeineüssigeVorbereitungstabilisierter,vonKG-1aabgeleiteterZellenmit
Antigen-AusdrucksowieCD45-undCD34-Verfärbungseigenschaften,dierepräsentativfürdiebeiCD34+HPC
gefundenensind.
PRINZIP
Stem-TrolControlCellssindkonservierteKG-1a-Zellen,diemodiziertundstabilisiertwurden,umdieCD34
KlasseIII-Epitope(2)unddasallgemeineCD45-Leukozyten-AntigenbeiDichtigkeitenvonannäherndnormalen
unreifenmenschlichenblutbildendenZellenwiederzugeben.EineMischungausStem-TrolControlCells,die
innormales,frischesVollbluteingeimpftwurden,wirdzuerstmitdenmonoklonalenAntikörper-Reagenzien
und7-AADViabilityDye-Vitalitätsfarbstoffeingefärbtundanschließendlysiert,umdieErythrozytenzu
entfernen.Stem-CountoderFlow-CountFluorosphereswerdenfürdiedirekteBestimmungderAbsolutzahlen
hinzugefügt.DieAnalysedereingefärbtenundlysiertenVorbereitungmitdemDurchusszytometerbestimmtdie
AbsolutzahlderZielzellen.DieerwartetenErgebnissewerdenmitStem-KitReagentsmithilfevongeprüftenund
standardisiertenFC500-DurchusszytometersystemenmitCXP-Systemsoftware(Version2.0)zurAnalyseder
Probenermittelt.
REAGENZIEN
Stem-TrolControlCellswerdenineinerisotonischenLösungmitStabilisatorenundBSAgelöst.Die
Assay-Zellkonzentration(Zellen/µL)leitetsichausmehrerenwiederholtenAnalysenmitderReferenzmethode
ab.DerspezielleWertbendetsichaufdemFläschchenetikett.
WARNUNGENUNDVORSICHTSMASSNAHMEN
1.ProbenmaterialundsämtlichemitdenProbeninKontaktkommendeMaterialiensolltenalspotentiell
infektiösesMaterialgehandhabtundmitdenentsprechendenanzuwendendenVorsichtsmaßnahmen
entsorgtwerden.
2.NiemalsmitdemMundpipettierenunddenKontaktvonProbenoderReagenzienmitHautundSchleimhäuten
vermeiden.
3.KeinReagenznachAblaufdesaufdemEtikettdesFläschchensangegebenenHaltbarkeitsdatumsanwenden.
4.Reagenziennichteinfrieren.
5.BeiLagerungoderVerwendungdieReagenziennichtderWärmeaussetzen.
6.DieFläschchennachderVerwendungmitKappenfestverschließen,umVerdunstungundAustrittdes
Reagenzeszuvermeiden;anderenfallskönnenfehlerhafteErgebnissedieFolgesein.
7.Stem-TrolControlCellssetzensichnacheinemlängerenZeitraumab.VordemGebrauchmüssenZellen
vollständigresuspendiertwerden.ZustarkesVermischenistzuvermeiden,umdieBlasenbildungzu
reduzieren.KeineLuftblasenpipettieren,sodasskeinefalschenErgebnisseerzieltwerden.

B60231–AE17of128
8.EinekalibriertepositiveVersetzungs-oderÜbertragungspipetteverwenden,umProbenundStem-TrolControl
CellszuverabreichenundfehlerhafteErgebnissezuvermeiden.
9.EsmüssendievomPipetten-HerstellerempfohlenenPipettiertechnikenangewendetwerden,umeine
genaueundpräzisePipettierungderProbenundderStem-TrolControlCellszuermöglichenundfehlerhafte
Ergebnissezuvermeiden.
10.JedeChargederStem-TrolControlCellsweisteinespezielleZellkonzentrationauf.StellenSiesicher,dass
dierichtigeAssay-Konzentrationverwendetwird,wenndieErgebnissefürdieAbsolutzahlbestimmtwerden.
11.BeiInkubationoderMischzeitenoderTemperaturen,dienichtdenSpezikationenentsprechen,können
fehlerhafteErgebnissedieFolgesein.
12.WenndasDurchusszytometernichtrichtigeingestelltoderfürdieFluoreszenzstandardisiertwurdeoderdie
ZellpopulationenmitfalschenGatesverwendetwerden,könnenfehlerhafteErgebnissedieFolgesein.
13.ErgebnissemitanderenDurchusszytometern,LysesystemenoderAntikörpern,dienormalerweisenicht
verwendetwerden,könnenmitMessfehlernbehaftetsein.
14.BeiderHandhabungdiesesReagenzesdieRegelneinergutenLaborpraxisbeachten.
GHS-GEFAHRSTOFFKLASSIFIZIERUNG
Nichtalsgefährlicheingestuft
DasSicherheitsdatenblattistauf
beckman.com/techdocsverfügbar.
LAGERUNG,STABILITÄTUNDENTSORGUNG
•StabilitätdesReagenzes:DiesesReagenzistbiszudemaufdemFläschchenetikettangegebenen
Haltbarkeitsdatumstabil,wennesungeöffnetbei2–8°Caufbewahrtwird.NachAblaufdes
Haltbarkeitsdatumsnichtmehrverwenden.DieStabilitätdesReagenzesbeträgt30Tage.
GeöffneteFläschchenmüssennachAnwendungwiederhermetischverschlossenundbei2bis8°C
aufbewahrtwerden.Nichteinfrieren.
•DieStem-TrolControlCellsvorderVerwendungaufRaumtemperatur(18–25°C)bringen.
WICHTIG:EsbestehtdasRisikofehlerhafterErgebnisse,wennLeckagenderStem-TrolControl
Cellsauftreten.NachdemÖffnenmüssendieStem-TrolControlCellsaufrechtgelagert
werden,ummöglicheLeckagenzuvermeiden.Reagenziendürfennichtmehrverwendet
werden,wennAnzeichenfürLeckagenzubeobachtensind.
ZeicheneinerSchädigung
WenndieerwartetenErgebnissenichterzieltwerdenkönnenodereineVerschiebungbeileichterStreuung
deruoreszierendenEigenschaftenauftritt,liegtmöglicherweiseeineProduktverschlechterungvor.Die
Instrumentenstandardisierung,dieTechnikenzurProbenvorbereitungunddieAntikörperleistungmüssen
ebenfallsuntersuchtwerden.
JedeVeränderungimphysischenAussehenderStem-TrolControlCells(normalesAussehen:farblose
Flüssigkeit)oderjedegrößereAbweichung(>15%ÄnderungenbeiderAbsolutzahl)beidenWertenausden
WiederholungstestsbeiderDurchusszytometer-AnalysekönnenaufeineVerschlechterunghinweisen,unddas
Reagenzdarfnichtweiterverwendetwerden.
VorbereitungdesReagenzes
Stem-TrolControlCellsstelleneinesoforteinsetzbareZellsuspensiondar.VordererstenPipettierungausdem
FläschchenisteinerichtigeDurchmischungerforderlich(10–12Sekundenlangdrehen).ZustarkesVermischen
istzuvermeiden,umdieBlasenbildungzureduzieren.KeineLuftblasenpipettieren.
ERFORDERLICHE,JEDOCHNICHTMITGELIEFERTEMATERIALIEN
•DeionisiertesWasser
•Stem-KitReagents(Reagenzien)(REFIM3630)mit7-AADViabilityDye-Vitalitätsfarbstoff.
•AlsAlternativezuStem-CountFluorospheres:Flow-CountFluorospheres(REF7547053)
•BadinEiswasser.
•HämolyseröhrchenausKunststoff(12x75mm)
•KalibriertepositiveVersetzungspipette(20µL,100µL,2mL)mitSpitzenoderkalibrierteÜbertragungspipette
(20µL,100µL,2mL)mitSpitzen.

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•KalibrierteStandardpipetten(20µL,100µL,2mL)mitSpitzen.
•Vortex-Rüttler
•Zeitgeber
•Durchusszytometer.
•stemCXP-SystemsoftwareNURfürdieautomatisierteAnalysederStem-TrolControlCellsan
FC500-DurchusszytometernmitderCXP-Software.
DURCHFÜHRUNG
EinevollständigeAnleitungzurautomatischenAnalyseistimstemCXPSystemGuide(System-Handbuch)der
stemCXP-Systemsoftwareenthalten.
WeitereInformationenzurmanuellenAnalysendenSieinderPackungsbeilagezudenStem-KitReagents
(Reagenzien)undunterderfolgendenVorgehensweise.
ANMERKUNG:ZurStandardisierungderAnalysebeimErhaltneuerStem-KitReagentsund
anschließendinregelmäßigentäglichenAbständeneineProzessprüfungdurchführen,
indemSiedieStem-TrolControlCellsmiteinernormalenumfänglichenBlutprobevon
einemgesundenSpendereinfärben.DaStem-TrolControlCellsstabilisierteZellen(also
nichtlebensfähigeZellen)sind,kannaußerdemdie7-AADViabilityDye-Vitalitätsfärbung
beiStem-TrolControlCellsvisuellüberprüftwerden(sieheÜberschrift:„Histogram
Creation“(Histogrammerstellung)).
DasDurchusszytometermussrichtigjustiertundfürdieFluoreszenzintensitätentsprechenddenAngabendes
HerstellersunddenLaborrichtlinienstandardisiertsein.DieEinstellungenfürdieFluoreszenzkompensation
müssenentsprechenddenAngabendesHerstellersunddenLaborrichtlinienrichtigjustiertsein.
DasKontrollreagenzunddieAntikörperaufRaumtemperaturbringen.
FürjedesExperimenteinProbenröhrchenbeschriften:TROL45/34/7-AAD.
1.20µLvonCD45-FITC/CD34-PEindasProbenröhrchenpipettieren.
2.20µL7-AADViabilityDye-VitalitätsfarbstoffindasProbenröhrchenpipettieren.
WICHTIG:EsbestehtdasRisikoeinerunvollständigenLysierung,wennBlutprobenobenoderan
derSeitedesProbenröhrchensverbleiben.BeimPipettierenvorsichtigvorgehen,umzu
verhindern,dassBlutandieOberseiteoderandieSeitedesProbenröhrchensgelangt.
DasProbenröhrchenbeiBedarfmiteinemBaumwolltupferreinigen,umalleSpurender
BlutprobevonderOberseiteoderderSeitedesProbenröhrchenszuentfernen.
3.IndenBodendesProbenröhrchensexakt100µLeinergutvermischennormalenVollblutprobemiteiner
kalibriertenpositivenVersetzungs-odereinerÜbertragungspipettepipettieren.
4.Stem-Trolvorbereitenundhinzufügen:
•DieStem-TrolControlCells5Sekundenlangvortexen.
•Exakt20µLderStem-TrolControlCellsindasProbenröhrchenpipettieren.
•DieProbenröhrchen5Sekundenlangvortexen.
5.BeiRaumtemperatur(18–25°C)20MinutenlangvorLichteinstrahlunggeschütztinkubieren.
6.2mLdervorbereiteten1XNH4ClLysingSolutionindasProbenröhrchengebenundsofort5Sekundenlang
drehen.
DetaillierteInformationenzurVorbereitungderLysingSolutionndenSieinderPackungsbeilagezuden
Stem-KitReagents.
7.BeiRaumtemperatur10MinutenlangvorLichteinstrahlunggeschütztinkubieren.
8.DieProbenröhrchenineinemGestellaufEislagern(2–8°C)undvorLichteinstrahlungschützen.
WICHTIG:EsbestehtdasRisikofehlerhafterErgebnisse,wennLuftblasenpipettiertwerden.
EineübermäßigeVermischungvonStem-CountoderFlow-CountFluorospheres
kannLuftblasenverursachen.DieStem-CountoderFlow-CountFluorospheresnicht
übermäßigvermischenundkeineLuftblasenindieProbenröhrchenpipettieren.

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9.DieStem-CountoderFlow-CountFluorospheresvorsichtigvermischen,indemSiedasRöhrchenvorder
Verwendung3bis5malumdrehen.EinzustarkesVermischenistnichtratsam,umdieBildungvonLuftblasen
zuvermeiden.
10.VorderEntnahme100µLvonStem-CountoderFlow-CountFluorospheresindasProbenröhrchenpipettieren.
11.SofortnachjedemHinzufügen5Sekundenlangvortexen.Bei2–8°Clagern.Drehvorgangunmittelbarvor
derEntnahmefürdieDurchusszytometriewiederholen.
WICHTIG:EsbestehtdasRisikofehlerhafterErgebnisse,wenndieProbenmehrals1Stundenach
demHinzufügenderStem-CountoderFlow-CountFluorospheresanalysiertwerden.
VorbereiteteProbenmüsseninnerhalb1StundenachdemHinzufügenderStem-Count
oderFlow-CountFluorospheresanalysiertwerden.
ÜbersichtüberVorbereitung(EtikettdesProbenröhrchens:TROL45/34/7-AAD)
ReagenzienundProbenVolumen
CD45-FITC/CD34-PE20µL
7-AAD-Lebensfähigkeits-Farbstoff20µL
Vollblut100µL
Stem-TrolControlCells20µL
Vortex–20MinutenbeiZimmertemperaturinkubierenlassen.VorLichteinfallschützen
1XNH4ClLysingSolution2mL
Vortex–10MinutenbeiZimmertemperaturinkubierenlassen.VorLichteinfallschützen
Stem-CountFluorospheres100µL
MANUELLEGATE-UNDANALYSEMETHODE
AufbaudesProtokolls
DerDurchusszytometermusszurErkennungvon„ForwardScatter“(Vorwärtsstreuung),„SideScatter“(seitliche
Streuung)undvonvierFluoreszenz-Kanälenausgestattetsein.FürdenFL3-Kanal(fürdieÜberwachungvon
Stem-CountoderFlow-CountFluorospheres)einen620-nm-Bandpasslterbenutzen.FürdenFL4-Kanal(fürdie
Überwachungvon7-AADViabilityDye-Vitalitätsfarbstoff)einen675nmlangenPasslterbenutzen.
ANMERKUNG:FürdieStem-TrolControlCellsmussdasselbeGate-SchemaunddieselbeReihemit8
Histogrammen,wiefürdieProbenanalyseangegeben,befolgtwerden.DaStem-Trol
ControlCellsähnlicheGrößenmerkmaleaufweisenundCD45-undCD34-Antigene
ineinerDichteannähernddernormalenunreifenblutbildendenZellenexprimieren,
müssendieRegionsgrenzenentlangderKanäle„ForwardScatter“(Vorwärtsstreuung),
Fluorescence1(Fluoreszenz1)undFluorescence2(Fluoreszenz2)nichtgeändert
werden.Dadie„SideScatter“-Merkmale(seitlicheStreuung)vonStem-TrolControl
Cellsjedocheindeutigsind,müssenSiedieRegionsgrenzenentlangvon„SideScatter“
(seitlicheStreuung)möglicherweisejustieren.DieRegionenA,B,CundD(siehedie
Überschrift„RegionCreation“(Regionserstellung)füreineDenitionderRegionen)
müssensogeändertwerden,dassderMerkmals-ClusterfürdieStem-TrolControl
Cellsenthaltenist.
ErstellenderHistogramme
FolgendeHistogrammeanlegen:
1.Histogramm1fürFL1CD45-FITCvs.„SideScatter“(seitlicheStreuung)erstellen.
2.Histogramm2fürFL2CD34-PEvs.„SideScatter“(seitlicheStreuung)erstellen.
3.Histogramm3fürFL1CD45-FITCvs.„SideScatter“(seitlicheStreuung)erstellen.
4.Histogramm4für„ForwardScatter“(Vorwärtsstreuung)vs.„SideScatter“(seitlicheStreuung)erstellen.
5.Histogramm5fürFL1CD45-FITCvs.FL2CD34-PEerstellen.
6.Histogramm6für„ForwardScatter“(Vorwärtsstreuung)vs.„SideScatter“(seitlicheStreuung)erstellen.
7.Histogramm7fürZeitvs.FL3Stem-CountoderFlow-CountFluorosphereserstellen.
8.Histogramm8fürFL47-AADvs.„SideScatter“(seitlicheStreuung)erstellen.

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DieHistogramme1bis4dienenderCharakterisierungvonCD34+-HPC.DieserProzesskannbiszum
Analyseschrittverzögertwerden.DieseerstenvierHistogrammewerdengemäßdenISHAGE-Richtlinienfürdie
CD34+-ZellbestimmungdurchdieDurchusszytometrieaufgestellt(2,3).
DieHistogramme5bis7sindzurÜberwachungderParametergedacht,diewährendderProbenentnahmewichtig
sind.Dazugehörender„ForwardScatter“-Diskriminator(fürdieVorwärtsstreuung),dieAnzahlderzusammelnden
CD45+-EreignisseunddierichtigeAkkumulationvonFluorosphere-Singuletten.
DasHistogramm8dientzumAnalysierenundUnterscheidenlebensfähigerEreignissevonnichtlebensfähigen
Ereignissen,fallserforderlich.
FestlegenderRegionen
FolgendeRegionenanlegen:
1.Histogramm1–EinegeradlinigeRegionAerstellen,umalleCD45+-Leukozyteneinzuschließenund
Blutplättchen,abgelagerteErythrozytenundAnsammlungenzubeseitigen.
2.Histogramm1–AmorpheRegionEfürdieLymphozytenerstellen(hellesCD45,niedrigeseitlicheStreuung).
3.Histogramm2–EinegeradlinigeRegionBfürHistogramm2erstellen,umalleCD34+-Ereignissemitniedriger
bismittlerer„SideScatter“(seitlicherStreuung)einzuschließen.EineEndzahlvon75000Ereignissen
(CD45+-Ereignissen)inHistogramm2festlegen.
4.Histogramm3–EineamorpheRegionCfürHistogramm3zumEinschließenallerclusterförmigen
CD45dim-Ereignisseerstellen.
5.Histogramm4–EineamorpheRegionDfürHistogramm4erstellen,umalleCluster-Ereignissemitmittlerer
seitlicherStreuungundmittlererbishoherVorwärtsstreuungeinzuschließen.
6.Histogramm5–Quadstat-RegionIfürHistogramm5erstellen,umdieUntergrenzedesCD45-Ausdrucksfür
CD34+-Ereignissezuüberprüfen.
7.Histogramm5–EineamorpheRegionHfürHistogramm5erstellen,umalleStem-CountoderFlow-Count
Fluorospheres,einschließlichDubletten,einzuschließen.RegionHmusssichinderrechtenoberenEcke
vonHistogramm5benden.
ANMERKUNG:Sicherstellen,dassRegionHalsRegionvomTypAMORPHOUS(amorph)gezeichnet
wird.
8.Histogramm6–RegionDausHistogramm4alsRegionFinHistogramm6kopieren.
9.Histogramm7–EinegeradlinigeRegionGfürHistogramm7erstellen,umnuralleSingulettenvon
Stem-CountoderFlow-CountFluorosphereseinzuschließen.RegionGkannmit„CAL“(Berechnung)
beschriftetwerden,umdieautomatischeBerechnungderAbsolutzahlenvonCD34+-HPCzuermöglichen
(weitereInformationenndenSieimInstrumentenhandbuch).
10.Histogramm8–EinegeradlinigeRegionJfürHistogramm8erstellen,umlebensfähigeLeukozyten(7-AAD
negativeEreignisse)vonnichtlebensfähigenEreignissen(hauptsächlichpositiveWertebeiStem-TrolControl
Cellsfür7-AADVerfärbung)zutrennen.
DenierenderGates
FolgendeGatesanlegen:
1.Histogramm1–Histogramm1denBuchstaben„H“zuweisen,umalleEreignisseaußerStem-Countoder
Flow-CountFluorospheresanzuzeigen.WeitereInformationenzumErstellenvon„notgates“(anderer
ElementealsGates)ndenSieimInstrumentenhandbuch.
2.Histogramm2–„A“zuHistogramm2zuweisen,umalleCD45+-Ereignisseanzuzeigen.
3.Histogramm3–„A“und„B“(AB)zuHistogramm3zuweisen,umalleCD45+-CD34+-Ereignisseanzuzeigen.
4.Histogramm4–„A“und„B“und„C“(ABC)zumHistogramm4hinzufügen,umalleCD45+-und
CD34+-Clusterereignissemitniedrigerbismittlerer„SideScatter“(seitlicherStreuung)undgeringem
CD45-Verfärbungsausdruckanzuzeigen.EreignisseausRegionABCDsindechteCD34+-HPC.
5.Histogramm5–KeinGate,damitalleEreignisseangezeigtwerden.
6.Histogramm6–„E“zuweisen,umLymphozytenalsvisuellePrüfungimDiskriminatoranzuzeigen.
7.Histogramm7–„H“zuHistogramm7zuweisen,umalleStem-CountoderFlow-CountFluorospheres,
einschließlichDubletten,anzuzeigen.