Beckman Coulter VersaLyse Lysing Solution Ready-for-use User manual

B59380–AD
MADEINFrance
VersaLyse
LysingSolution
.
1mL/test,A09777
100tests;100mL
TABLEOFCONTENTS
English........................................................2
Français(FR).....................................................7
Deutsch(DE)....................................................13
Italiano(IT).....................................................19
Español(ES).....................................................25
PortuguêsPortugal(PT-PT)..............................................31
Dansk(DA).....................................................37
Svenska(SV)....................................................42
Norsk(NO).....................................................47
Ελληνικά(EL)....................................................52
Lietuviškai(LT)....................................................58
Magyar(HU).....................................................63
Polski(PL)......................................................68
Čeština(CZ).....................................................74
Slovenčina(SK)...................................................80
Türkçe(TR).....................................................85
Русский(RU)....................................................90
eestikeel(ET)....................................................96
Hrvatski(HR).....................................................101
Български(BG)...................................................106
Română(RO)....................................................112
Србија(SR).....................................................117
Latviešu(LV).....................................................122
Українська(UK)...................................................127
APPENDIX.....................................................133
REFERENCES....................................................134
©2019BeckmanCoulter,Inc.Allrightsreserved.

B59380–AD2of135
Specications
VersaLyseLysingSolutionReady-for-use
FormulationLiquid
Volume100mL
Numberofvials1vial
Volumepertest1mL(ready-for-usewhenusedwithnoconcomitantxation)
VersaLyse
LysingSolution
.
1mL/test,A09777
100tests;100mL
ForInVitroDiagnosticUse
INTENDEDUSE
Thisreagentisintendedforthelysisofredbloodcellsinthepreparationofbiologicalsamplesforowcytometry
analysis.VersaLyseiscompatiblewithalltypesofcytometersandisusedwithorwithoutwashingafterincubation,
aslongasproperlycalibrateduorescentantibodiesareusedintheprotocol.VersaLysealsomakesitpossibleto
treatsamplesevenwhentheyhavebeenwashedearlier,inordertoeliminateserumimmunoglobulinsforexample
(1,2,3,4,5).
PRINCIPLE
ThesamplecontainingtheredbloodcellstobelysedisexposedtotheVersaLysereagentforatleast10minutes.
ThemajoractiveingredientofVersaLyseisacyclicaminewhich,incontactwithcarbonicanhydrasepresentin
redbloodcells,istransformedintoacompoundwhichishighlylyticforthesecells.
Thisreagentisusedwithspecicconjugatedantibodies,abletobindtoleucocytesduetotheantigenic
determinantstheyexpress.Thespecicstainingofleucocytesisachievedbyincubatingthesamplewiththe
antibodyorantibodies.Theredcellsarethenremovedbylysisandtheleucocytes,unaffectedbythisprocess,
areanalyzedbyowcytometry.
Preparationsmustbestoredbetween2and8°Candanalyzedrapidlyusingowcytometry.Inthecaseofadelay
ofseveralhoursbeforeanalysis,theymaybexedwithPBScontaining0.1%formaldehyde(seethetechnical
leaetoftheIOTest3FixativeSolution–Ref.A07800–topreparethisPBSwith0.1%formaldehyde).Inthis
case,priorwashingisnecessary.
Theowcytometermeasureslightdiffusionandtheuorescenceofcells.Itmakespossiblethedelimitationofthe
populationofinterestwithintheelectronicwindowdenedonahistogram,whichcorrelatestheorthogonaldiffusion
oflight(SideScatterorSS)andthediffusionofnarrow-anglelight(ForwardScatterorFS).Otherhistograms
combiningtwoofthedifferentparametersavailableonthecytometercanbeusedasanaidinthegatingstage
dependingontheapplicationchosenbytheuser.
Theuorescenceofthedelimitedcellsisanalyzedinordertodistinguishthepositively-stainedeventsfromthe
unstainedones.Theresultsareexpressedasapercentageofpositiveeventsinrelationtoalltheeventsacquired
bythegating.
WARNINGANDPRECAUTIONS
1.Donotusethereagentbeyondtheexpirydate.
2.Donotstoreintherefrigerator,donotfreeze.
3.Minimizeexposuretolightduringincubationwithuorescentantibodies.
4.Avoidmicrobialcontaminationofthereagents,orfalseresultsmayoccur.
5.Formaldehydeistoxicandallergenic.Itisthoughttobecarcinogenic.Neverpipettebymouthandavoidall
contactwiththeskin,mucosa,eyesandclothing.
6.Allbloodsamplesmustbeconsideredaspotentiallyinfectiousandmustbehandledwithcare(inparticular:
thewearingofprotectivegloves,gownsandgoggles).
7.Bloodtubesanddisposablematerialusedforhandlingshouldbedisposedofinadhoccontainersintended
forincineration.

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GHSHAZARDCLASSIFICATION
VersaLyseLysingSolutionWARNING
H315Causesskinirritation.
H319Causesseriouseyeirritation.
P280Wearprotectivegloves,protective
clothingandeye/faceprotection.
P302+P352IFONSKIN:Washwithplentyof
soapandwater.
P305+P351+P338IFINEYES:Rinsecautiouslywith
waterforseveralminutes.Remove
contactlenses,ifpresentandeasy
todo.Continuerinsing.
P332+P313Ifskinirritationoccurs:Getmedical
advice/attention.
P337+P313Ifeyeirritationpersists:Get
medicaladvice/attention.
P362+P364Takeoffcontaminatedclothingand
washitbeforeuse.
HydrochloricAcid0.5-1.0%
Pyrrolidine1-2%
SafetyDataSheetisavailableattechdocs.beckmancoulter.com
STORAGEANDSTABILITY
VersaLyseisstoredbetween18and25°C.IfavialofVersaLysehasbeenkeptinadvertantlyinarefrigerator,bring
ittoroomtemperature(18–25°C)andwaitatleastonehourbeforeuse.
Withthevialclosed,thereagentisstableuptotheexpirydateshownonthevial.
Afteropening,thereagentisstablefor90days.
SAMPLES
VenousbloodorbonemarrowsamplesmustbetakenusingsteriletubescontaininganEDTAsaltasthe
anticoagulant.
NB:CarefullyreadintheANTICOAGULANTsection,theconditionsunderwhichotheranticoagulantscanbeused.
Thesamplesshouldbekeptatroomtemperature(18–25°C)andnotshaken.Thesampleshouldbehomogenized
bygentleagitationpriortotakingthetestsample.
Thesamplesmustbeanalyzedwithin24hoursofvenipuncture.
WASHEDSAMPLES
Ifyouhavetowashthesamplesbeforestainingfollowedbylysisoftheredbloodcells,itisessentialtoremove
allthesupernatantafterthelastcentrifugation.Anexcessofwashingbufferonthecellpelletcanreducethe
effectivenessofVersaLyse.
PREPARATIONOFSAMPLES
Theconcentrationofleucocytesinthesamplemustbelessthan104cells/µL(1010/L).Ifnecessary,diluteinPBS
tobringtheleucocyteconcentrationto5x103/µL(5x109/L).
Theerythrocyticconcentrationinthesamplemustbelessthan6x106/µL(6x1012/L),itisrecommendedtodilute
sampleinPBSinordertobringtheerythrocyticconcentrationto5x106/µL.
Ifboththeleucocyticanderythrocyticconcentrationsneedadjusting,thehighestdilutionmustbeused.The
proceduresuse100µLofanon-predilutedorpre-dilutedsamplepertube.
EVIDENCEOFDETERIORATION
Anychangeinthephysicalappearanceofthereagentsmayindicatedeteriorationandthereagentshouldnotbe
used.

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Incaseofpackagingdeteriorationorifdataobtainedshowsomeperformancealteration,pleasecontactyourlocal
distributororusethefollowinge-mailaddress:
[e-mail]
MATERIALSNEEDEDBUTNOTSUPPLIEDWITHKIT:
•Samplingtubesandmaterialnecessaryforsampling.
•Automaticpipetteswithdisposabletipsfor10,20,100and1,000µL.
•Plastichaemolysistubes.
•Calibrationbeads:Flow-SetFluorospheres(Ref.6607007).
•Specicuorescentantibodies.
•Isotypiccontrols.
•Buffer(PBS:0.01Msodiumphosphate;0.145Msodiumchloride;pH7.2).
•Fixationreagent:forexampleIOTest3FixativeSolution(Ref.A07800).
•Centrifuge.
•Automaticagitator(Vortextype).
•Flowcytometer.
PROCEDUREwithVERSALYSEREAGENT
Note:Theproceduresbelowarevalidforstandardapplications.Sampleand/orVersaLysevolumesforcertain
BeckmanCoulterapplicationsmaybedifferent.Ifsuchisthecase,followtheinstructionsonthetechnicalleaet
oftheapplication.
A–Procedurewithoutconcomitantxation
Preparationofthereagent
Nopreparationisnecessary.UseVersaLysedirectlyfromthevial.
Foreachsampleanalyzed,inadditiontothetesttube,onecontroltubeisrequiredinwhichtheisotypiccontrol
correspondingtothespecicstainingselectedisaddedtothecells.
1.Ineachtesttubeaddtheamountofantibodyrecommendedbythemanufacturerinordertostain5x105
leucocytes.
2.Ineachcontroltubeaddtheamountoftheisotypiccontrolrecommendedbythemanufacturertostain5x105
leucocytes.
3.Add100µLofthesample(predilutedorotherwise)tobothtubes.Vortexthetubesgently.
4.Incubatefollowingtheconditionssetoutinthetechnicalleaetfortheantibodiesused.
5.Add1mLofVersaLyseandvorteximmediatelyfor1second.
6.Incubateatleast10minutesatroomtemperature(18–25°C),protectedfromlight.
Inthecaseofaprocedurewithoutwashing,thetubesarereadyforcytometricanalysis.
NB:Ifthepreparationsneedtobewashed,donotanalyzebeforeperformingsteps7to11.
7.Centrifugefor5minutesat150xgatroomtemperature.
IMPORTANT:Ithasbeennotedthat,whenusingthenonconcomitantxationprocedurewithawashstep,
celldoublets,knownasescapees,maybeformed,possiblyresultinginerroneousresultsduetochangein
theirlightscatterpropertiesandtothefactthattheyescapeoutofthegatingregions(6).Arigorousvortexing
maydisruptthesedoublets.
8.Removethesupernatantbyaspiration.
9.Resuspendthecellpelletin3mLofPBS.
10.Centrifugefor5minutesat150xgatroomtemperature.
11.Removethesupernatantbyaspirationandresuspendthecellpelletin:
•0.5mLor1mLofPBSplus0.1%offormaldehydeifthepreparationsaretobekeptlessthan24hours.(A
0.1%formaldehydePBScanbeobtainedbydiluting12.5µLoftheIOTest3FixativeSolution(Ref.A07800)
atits10Xconcentrationin1mLofPBS).
•0.5mLor1mLofPBSwithoutformaldehyde,ifthepreparationsaretobeanalyzedwithin2hours.

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Note:Inallcases,keepthepreparationsatbetween2and8°Candprotectedfromlight.
B–Procedurewithconcomitantxation
Preparationofthereagent
Extemporaneouslypreparethe“Fix-and-Lyse”mixturebyadding25µLofUNDILUTEDIOTest310X*Fixative
Solution(Ref.A07800)to1mLofVersaLyse.
Vortexthetubesfor3to5seconds.
(*)NB:inthecontextofthe“Fix-and-Lyse“mixture,theIOTest3Fixativesolution(Ref.A07800)isusedataforty
foldconcentratedsolutionandnotasa10Xsolution(nominalconcentration).
Prepareasufcientvolumeofthe“Fix-andLyse”mixturedependingonthenumberofsamplestobelysed(1mL
ofmixturepertube).
Foreachsampleanalyzed,inadditiontothetesttube,onecontroltubeisrequiredinwhichthecellsaremixed
withtheisotypiccontrolcorrespondingtothespecicstainingselected.
1.Ineachtesttube,addtheamountofantibodyrecommendedbythemanufacturertostain5x105leucocytes.
2.Ineachcontroltube,addtheamountofisotypiccontrolrecommendedbythemanufacturertostain5x105
leucocytes.
3.Add100µLofthesample(predilutedorotherwise)tobothtubes.Vortexthetubesgently.
4.Incubatefollowingtheconditionssetoutinthetechnicalleaetfortheantibodiesused.
5.Add1mLofthe“Fix-and-Lyse“mixtureandvorteximmediatelyfor1second.
6.Incubateatleast10minutesatroomtemperature(18–25°C),protectedfromlight.
Inthecaseofaprocedurewithoutwashing,thetubesarereadyforcytometricanalysis.
NB:Ifthepreparationsneedtobewashed,donotanalyzebeforeperformingsteps7to11.
7.Centrifugefor5minutesat150xgatroomtemperature.
8.Removethesupernatantbyaspiration.
9.Resuspendthecellpelletin3mLofPBS.
10.Centrifugefor5minutesat150xgatroomtemperature.
11.Removethesupernatantbyaspirationandresuspendthecellpelletin0.5mLor1mLofPBSplus0.1%
offormaldehydeifthepreparationsaretobekeptlessthan24hours.(A0.1%formaldehydePBScanbe
obtainedbydiluting12.5µLoftheIOTest3FixativeSolution(Ref.A07800)atits10Xconcentrationin1mL
ofPBS).
Thesepreparationsmaybekept24hoursbetween2and8°Candprotectedfromlight.
ANTICOAGULANT
ThetripotassiumsaltofEDTA(K3EDTA)givesthebestresults,irrespectiveofthemethodologyused,withor
withoutwashingafterlysis.
ACDandheparingivegoodresultswithallproceduresexcepttheprocedurewithoutconcomitantxationwhenitis
followedbywashing.Withtheseanticoagulants,werecommendtheprocedurewithconcomitantxation,followed
bywashing.
ANALYSIS
Theerythrocyteresiduescangiverisetoadiffractionsignalofthenarrowanglelight(ForwardScatterorFS)
greaterthanthatobtainedwithothercommerciallysisreagents.Asaresult,theusualadjustment(orxedby
default)ofthe("threshold")discriminatoronthisparametermaybetooweakforVersaLyse.
Itisthereforeadvisabletoadjustthecytometerduringtherstmomentsoftheacquisitionofatypicalpreparation.In
thecaseofwholelysedbloodforexample,itisadvisablersttoincreaseprogressivelythevalueofthediscriminator
untiltheleucocytepopulationsarevisibleonahistogramoftheFStypeversusSS;thentocarefullyadjustthe
amplicationoftheFSandSSsignalstoobtainadistributionoftheleucocyticpopulationsidenticaltothatofgures
1and2.
PERFORMANCE
purityandlymphocyticrecovery
PurityandlymphocyticrecoveryhavebeenevaluatedaccordingtotherecommendationsoftheCDC(1).The
bloodof10healthydonorssampledinK3EDTAwaslabeledwithamixtureofmonoclonalantibodiesCD45-FITC

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andCD14-PE.Themeanvaluesoftherecoveryandpurityaswellastherangeforthedifferentproceduresare
giveninthefollowingtables:
Withoutwashing
WithoutconcomitantxationWithconcomitantxation
RecoveryPurityRecoveryPurity
96.492.396.691.6
95/97.590.1/94.395.4/98.190.1/92.6
Withwashing
WithoutconcomitantxationWithconcomitantxation
RecoveryPurityRecoveryPurity
95.694.096.297.2
95/97.390.3/97.395.4/97.592.7/99.4
INTRA-LABORATORYREPRODUCIBILITY
Onthesamedayandonthesamecytometer,31measurementsofthepercentageofCD3+lymphocyteswere
carriedoutonthesamesample(wholebloodfromahealthydonor).Thelysisprocedureusedwasconcomitant
xationintheabsenceofwashing.Theresultsobtainedaresummarizedinthefollowingtable:
WholebloodNumberMean(%)SDCV(%)
CD3+
Lymphocytes
3160.721.612.7
LIMITATIONS
1.Flowcytometrymayproducefalseresultsifthecytometerhasnotbeenalignedperfectly,ifuorescenceleaks
havenotbeencorrectlycompensatedforandiftheregionshavenotbeencarefullypositioned.
2.Accurateandreproducibleresultswillbeobtainedaslongastheproceduresusedareinaccordancewiththe
technicalinsertleaetandcompatiblewithgoodlaboratorypractices.
3.Inthecaseofahyperleucocytosis,dilutethebloodinPBSsoastoobtainavalueofapproximately5x109
leucocytes/L(7).
4.Inthecaseofapolyglobulinaemia,dilutethespecimeninPBSsoastoobtain5x1012redbloodcells/L(8,9,
10).
5.VersaLysemustbebroughttoroomtemperature(18–25°C)beforeuse.
6.Verifythepreparationsusingthenakedeyetoassesstheefcacyoflysis.Iftheyarecloudyorifthelight
diffractionhistogramsareunusual,lysismaybeincomplete.
7.Theerythroblastsmaybeincompletelylysedandappearonalightdiffractionhistograminthesamelocation
astheleucocytes(11).
8.Acetazolamide,aninhibitorofcarbonicanhydrasecancompletelyinhibittheactionofVersaLyse(12).
9.Incertaindiseasestates,suchassevererenalfailureorhaemoglobinopathies,lysisofredcellsmaybeslow,
incompleteorevenimpossible.Inthiscase,itisrecommendedtoisolatemononucleatedcellsusingadensity
gradient(Ficoll,forexample)priortostaining(13).
TRADEMARKS
BeckmanCoulter,thestylizedlogo,andtheBeckmanCoulterproductandservicemarksmentionedhereinare
trademarksorregisteredtrademarksofBeckmanCoulter,Inc.intheUnitedStatesandothercountries.
SymbolsKey
GlossaryofSymbolsisavailableatbeckman.com/techdocs(documentnumberB60062)

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Spécications
SolutiondeLyseVersaLyseprêteàl’emploi
FormeLiquide
Volume100mL
Nombredeacons1acon
Volumepartest1mL(prêtàl’emploidansuneutilisationsansxationconcomitante)
VersaLyse
SolutiondeLyse
1mL/test,A09777100tests;100mL
Réservéauxdosagesdiagnostiquesinvitro
UTILISATION
Ceréactifestdestinéàlalysedesglobulesrougeslorsdelapréparationd’échantillonsbiologiquespourl’analyse
parcytométrieenux.VersaLyseestcompatibleavectoustypesdecytomètresets’utiliseavecousanslavage
aprèsincubation,danslamesureoùonemploiedesanticorpsuorescentsdûmentcalibréspourleprotocole
choisi.VersaLysepermetenoutredetraiterleséchantillonsmêmelorsqu’ilsontétépréalablementlavésan,par
ex.,d’éliminerlesimmunoglobulinessériques(1,2,3,4,5).
PRINCIPE
L’échantilloncontenantleshématiesàlyserestmisenprésenceduréactifVersaLysependantaumoins10
minutes.LecomposantactifmajeurdeVersaLyseestuneaminecycliquequi,aucontactdel’anhydrase
carboniquecontenuedansleshématies,setransformeenuncomposéhautementlytiquepourcescellules.
Ceréactifs’utiliseavecdesanticorpsconjuguésspéciquesquiontlacapacitédesexersurdescellules
leucocytairesparlesdéterminantsantigéniquesqu’ellesexpriment.Lemarquagespéciquedesleucocytesest
réaliséenincubantl’échantillonavecleoulesanticorps.Lesérythrocytessontensuiteéliminésparlyseetles
leucocytes,nonaffectésparcetteétape,sontanalysésparcytométrieenux.
Lespréparationsdoiventêtreconservéesentre2et8°Cetrapidementanalyséesaucytomètreenux.Encasde
reportdel’analysedequelquesheures,ellespeuventêtrexéesavecduPBScontenant0,1%deformaldéhyde
(VoirlachetechniquedelaSolutiondeFixationIOTest3–Réf.A07800–pourpréparercePBSà0,1%de
formaldéhyde).Danscecas,unlavagepréalableestnécessaire.
Lecytomètreenuxmesureladiffusiondelalumièreainsiquelauorescencedescellules.Ilpermetde
circonscrirelapopulationd’intérêtàl'intérieurd’unefenêtreélectroniquedéniesurunhistogrammequicorrèlela
diffusionorthogonaledelalumière("SideScatter"ouSS)etladiffusiondelalumièreauxpetitsangles(“Forward
Scatter”ouFS).D’autreshistogrammescombinantdeuxdesdifférentsparamètresdisponiblessurlecytomètre
sontutilisablescommesupportsàl’étapedefenêtrageélectroniqueenfonctiondel’applicationchoisiepar
l’utilisateur.
Lauorescencedescellulesainsifenêtréesestanalyséepourdistinguerlesévénementspositivementmarqués
desévénementsnonmarqués.Lesrésultatssontexprimésenpourcentaged’événementspositifsparrapportà
l'ensembledesévénementsprisencompteparlefenêtrageélectronique.
AVERTISSEMENTSETPRÉCAUTIONS
1.Nepasutiliserleréactifau-delàdeladatedepéremption.
2.Nepasmettreauréfrigérateur,nepascongeler.
3.Minimiserlestempsd’expositionàlalumièrependantlesincubationsaveclesanticorpsuorescents.
4.Eviterlacontaminationmicrobiennedesréactifsoudesrésultatserronéspeuventapparaître.
5.Leformaldéhydeesttoxiqueetallergénique.Onlesuspected’êtreunagentcarcinogèneNejamaispipeter
àlaboucheetévitertoutcontactaveclapeau,lesmuqueuses,lesyeuxetlesvêtements.
6.Toutéchantillonsanguindoitêtreconsidérécommepotentiellementinfectieuxetdoitêtremanipuléavecles
précautionsd'usage(enparticulier:portdegants,deblouseetdelunettesdeprotection).
7.Lestubesdesangetlematérielàusageuniqueayantserviàlamanipulationdoiventêtreéliminésdansdes
conteneursadhocdestinésàl'incinération.

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CLASSIFICATIONDESRISQUESSGH
VersaLyse:solutiondelyseATTENTION
H315Provoqueuneirritationcutanée.
H319Provoqueunesévèreirritationdes
yeux.
P280Porterdesgantsdeprotection,
desvêtementsdeprotectionet
unéquipementdeprotectiondes
yeux/duvisage.
P302+P352ENCASDECONTACTAVECLA
PEAU:laveretabondammentà
l’eauetausavon.
P305+P351+P338ENCASDECONTACTAVECLES
YEUX:rinceravecprécautionà
l’eaupendantplusieursminutes.
Enleverleslentillesdecontact
silavictimeenporteetsielles
peuventêtrefacilementenlevées.
Continueràrincer.
P332+P313Encasd’irritationcutanée:
demanderunavis
médical/consulterunmédecin.
P337+P313Sil’irritationdesyeux
persiste:demanderunavis
médical/consulterunmédecin.
P362+P364Enleverlesvêtementscontaminés
etleslaveravantutilisation.
Acidechlorhydrique0,5-1,0%
Pyrrolidine1-2%
Lachetechniquesanté-sécuritéestdisponibleàl’adresse
techdocs.beckmancoulter.com
CONSERVATIONETSTABILITE
VersaLyseseconserveentre18et25°C.SiunacondeVersaLyseaétéplacéparinadvertanceauréfrigérateur,
leremettreàtempératureambiante(18–25°C)etattendreaumoinsuneheureavantdel’utiliser.
Flaconfermé,leréactifeststablejusqu’àladatedepéremptionindiquéesurleacon.
Aprèsouverture,leréactifrestestablependant90jours.
ÉCHANTILLONS
Lesprélèvementsdesangveineuxoudemoelleosseusedoivents'effectuersurtubesstérilescontenantunsel
d'EDTAcommeanticoagulant.
NotaBene:LireattentivementauparagrapheANTICOAGULANTlesconditionsdanslesquellesd’autres
anticoagulantspeuventêtreutilisés.
Leséchantillonsseconserventàtempératureambiante(18–25°C)etsansagitation.Avantd'effectuerlaprise
d'essai,ilestrecommandéd'homogénéiserleprélèvementparagitationdouce.
Leséchantillonsdoiventêtreanalysésdansles24heuresquisuiventleprélèvement.
SPECIMENSLAVES
Sivousdevezlaverlesspécimensavantdeprocéderaumarquagepuisàlalysedesglobulesrouges,ilest
impératifd’éliminerlatotalitédusurnageantaprèsladernièrecentrifugation.Unexcèsdetampondelavagesur
leculotcellulairepeutréduirel’efcacitédeVersaLyse.
PREPARATIONDESSPECIMENS

B59380–AD9of135
Laconcentrationdeleucocytesdansl’échantillondoitêtreinférieureà104cellules/µL(1010/L).Diluersinécessaire
dansduPBSpourramenerlaconcentrationleucocytaireà5x103/µL(5x109/L).
Laconcentrationd’érythrocytesdansl’échantillondoitêtreinférieure6x106/µL(6x1012/L),ilestrecommandéde
diluercelui-cidansduPBSanderamenerlaconcentrationérythrocytaireà5x106/µL.
Silesconcentrationsleucocytaireetérythro-cytairesontàajuster,ilfauteffectuerladilutionlaplusélevée.Les
procéduresutilisent100µLdespécimenprédiluéounonpartube.
PREUVEDEDÉTÉRIORATION
toutchangementd’apparencephysiqueduproduitpeutindiquerunedeteriorationetleproduitnedoitpasêtre
utiliser.
Encasdedéteriorationdel'emballageousilesrésultatsobtenusmontrentunepertedeperfomanceduproduit,
veuillezcontacternotreserviceSupportTechnique:
Tel:[phone]Fax:[phone]e-mail:[e-mail]
MATERIELNECESSAIREMAISNONFOURNIAVECCECOFFRET:
•Tubesàprélèvementetmatérielnécessaireauxprélèvements.
•Pipettesautomatiquesetemboutsjetablespourpréleverdesquantitésde10,20,100et1000µL.
•Tubesàhémolyseenplastique.
•Billesdecalibration:FluorosphèresFlow-Set(Réf.6607007).
•Anticorpsuorescentsspéciques.
•Contrôlesisotypiques.
•Tampon(PBS:0,01Mphosphatedesodium;0,145Mchloruredesodium;pH7,2).
•Réactifdexation:Atitred’exemple:SolutiondeFixationIOTest3(Réf.A07800).
•Centrifugeuse.
•Agitateurautomatique(typeVortex).
•Cytomètreenux.
PROCÉDUREavecRÉACTIFVERSALYSE
NotaBene:Lesprocéduresci-aprèssontvalablespourdesapplicationsstandard.Lesvolumesd’échantillon
et/oudeVersaLysepourcertainesapplicationsBeckmanCoulterpeuventêtredifférents.Sitelestlecas,ilfaut
suivrelesinstructionsdelachetechniquedel’application.
A–Procéduresansxationconcomitante
Préparationduréactif
Aucunepréparationn’estnécessaire.UtiliserVersaLysedirectementàpartirduacon.
Pourchaqueéchantillonanalysé,prévoirenplusdutubetest,untubecontrôledanslequellescellulesseront
misesenprésenceducontrôleisotypiquecorrespondantaumarquagespéciquechoisi.
1.Danschaquetubetest,introduirelaquantitéd’anticorpsrecommandéeparlefabricantpourmarquer5x105
leucocytes.
2.Danschaquetubecontrôle,introduirelaquantitédecontrôleisotypiquerecommandéeparlefabricantpour
marquer5x105leucocytes.
3.Ajouter100µLdel’échantillonàtester(prédiluéounon)dansles2tubes.Vortexerdoucement.
4.Incuberselonlesconditionsstipuléesdanslachetechniquedesanticorpsutilisés.
5.Ajouter1mLdeVersaLyseetvortexerimmédiatement1seconde.
6.Incuberauminimum10minutesàtempératureambiante(18–25°C)etàl'abridelalumière.
Danslecasd’uneprocéduresanslavage,lestubessontprêtspourl’analyseaucytomètre.
NotaBene:Silespréparationsdoiventêtrelavées,nepasanalyseravantd’avoirréalisélesétapes7à11
suivantes.
7.Centrifugerà150xgpendant5minutesàtempératureambiante.
IMPORTANT:Ilaétéremarqué,lorsdel’utilisationdecetteprocéduresansxationconcomitante,qu’une
étapedelavagepouvaitentraînerlaformationdedoubletsdecellules,appelés"escapees"enanglais,car,

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comptetenudeleurscaractéristiquesdediffusiondelalumière,ilssortentdesrégionsdeconditionnement
etconduisentàdesrésultatserronés(6).Uneagitationrigoureuseauvortexpermetdelesdissocier.
8.Eliminerlesurnageantparaspiration.
9.Resuspendreleculotcellulairedans3mLdePBS.
10.Centrifugerà150xgpendant5minutesàtempératureambiante.
11.Eliminerlesurnageantparaspirationetresuspendreleculotcellulairedans:
•0,5mLou1mLdePBSplus0,1%deformaldéhydesilespréparationsdoiventêtreconservéesmoinsde
24heures.(UnPBSavec0,1%deformaldéhydepeutêtreobtenuendiluant12,5µLdelasolutiondexation
IOTest3(REFA07800)carc’estsaconcentration10xdans1mLdePBS).
•0,5mLou1mLdePBSsansformaldéhyde,silespréparationssontdestinéesàêtreanalyséesdansles2
heures.
NotaBene:Danstouslescas,conserverlespréparationsentre2et8°Cetàl'abridelalumière.
B–Procédureavecxationconcomitante
Préparationduréactif
Préparerextemporanémentlemélange“Fix-and-Lyse“enajoutant25µLdeSolutiondeFixationIOTest310X*
NONDILUEE(Réf.A07800)à1mLdeVersaLyse.
Vortexerde3à5secondes.
(*)NotaBene:danslecadredumélange“Fix-and-Lyse“,laSolutiondeFixationIOTest3(Réf.A07800)estutilisée
commeunesolutionquarantefoisconcentréeetnonpascommeunesolution10X(concentrationnominale).
Préparerunvolumesufsantdemélange“Fix-and-Lyse“enfonctiondunombred’échantillonsàlyser,àraisonde
1mLdecemélangepartube.
Pourchaqueéchantillonanalysé,prévoirenplusdutubetest,untubecontrôledanslequellescellulesseront
misesenprésenceducontrôleisotypiquecorrespondantaumarquagespéciquechoisi.
1.Danschaquetubetest,introduirelaquantitéd’anticorpsrecommandéeparlefabricantpourmarquer5x105
leucocytes.
2.Danschaquetubecontrôle,introduirelaquantitédecontrôleisotypiquerecommandéeparlefabricantpour
marquer5x105leucocytes.
3.Ajouter100µLdel’échantillonàtester(prédiluéounon)dansles2tubes.Vortexerdoucement.
4.Incuberselonlesconditionsstipuléesdanslachetechniquedesanticorpsutilisés.
5.Ajouter1mLdemélange“Fix-and-Lyse“etvortexerimmédiatement1seconde.
6.Incuberauminimum10minutesàtempératureambiante(18–25°C)etàl'abridelalumière.
Danslecasd’uneprocéduresanslavage,lestubessontprêtspourl’analyseaucytomètre.
NotaBene:Silespréparationsdoiventêtrelavées,nepasanalyseravantd’avoirréalisélesétapes7à11
suivantes.
7.Centrifugerà150xgpendant5minutesàtempératureambiante.
8.Eliminerlesurnageantparaspiration.
9.Resuspendreleculotcellulairedans3mLdePBS.
10.Centrifugerà150xgpendant5minutesàtempératureambiante.
11.Éliminerlesurnageantparaspirationetremettreleculotcellulaireensuspensiondans0,5mLou1mLde
PBSavec0,1%deformaldéhyde,silespréparationsdoiventêtreconservéesmoinsde24heures.(UnPBS
avec0,1%deformaldéhydepeutêtreobtenuendiluant12,5µLdelasolutiondexationIOTest3(REF
A07800)carc’estsaconcentration10xdans1mLdePBS).
Entre2et8°Cetàl'abridelalumièrecespréparationspeuventêtreconservées24heures.
ANTICOAGULANT
Leseltripotassiqued’EDTA(K3EDTA)donne,quellequesoitlaméthodologieemployée,avecousanslavage
aprèslalyse,lesmeilleursrésultats.

B59380–AD11of135
L’ACDetl’héparinedonnentdebonsrésultatsavectouteslesprocéduressauflaprocéduresansxation
concomitantelorsqu’elleestsuivied’unlavage.Aveccesanticoagulants,nousrecommandonslaprocédureavec
xationconcomitante,suivied’unlavage.
ANALYSE
Lesrésidusd’érythrocytespeuventdonnerunsignaldediffractiondelalumièreauxpetitsangles(“ForwardScatter“
ouFS)supérieuràceluiobtenuavecd’autresréactifsdelysecommerciaux.Decefait,leréglagehabituel(ouxé
pardéfaut)dudiscriminateur(“threshold“)surceparamètrepeuts’avérertropfaiblepourVersaLyse.
Ilestdoncrecommandéderéglerlecytomètredanslespremiersinstantsdel’acquisitiond’unepréparationtype.
Danslecasd’unsangtotallysé,parexemple,ilconvientd’abordd’augmenterprogressivementlavaleurdu
discriminateurjusqu’àcequelespopulationsleucocytairessoientvisiblessurunhistogrammedetypeFSversus
SS;puisderéglernementl’amplicationdessignauxFSetSSpourobtenirunerépartitiondespopulations
leucocytairesidentiqueàcelledesgures1,ou2.
PERFORMANCES
PURETEETRECOUVREMENTLYMPHOCYTAIRES
LapuretéetlerecouvrementlymphocytairesontétéévaluéssuivantlesrecommandationsduCDC(1).Lesang
de10donneurssains,prélevésurK3EDTA,aétédoublementmarquéaumoyend’unmélanged’anticorps
monoclonauxCD45-FITCetCD14-PE.Lamoyennedesrecouvrementsetdespuretésainsiquelesvaleurs
extrêmesdesdifférentesprocéduressontdonnésdanslestableauxsuivants:
Sanslavage
SansxationconcomitanteAvecxationconcomitante
ReprisePuretéReprisePureté
96,492,396,691,6
95/97,590,1/94,395,4/98,190,1/92,6
Aveclavage
SansxationconcomitanteAvecxationconcomitante
ReprisePuretéReprisePureté
95,694,096,297,2
95/97,390,3/97,395,4/97,592,7/99,4
REPRODUCTIBILITEINTRA-LABORATOIRE
Lemêmejouretsurlemêmecytomètre,31déterminationsdupourcentagedelymphocytesCD3+ontétémenées
surlemêmeprélèvement(sangtotald’undonneursain).Laprocéduredelyseutiliséeaétécelleavecxation
concomitanteetabsencedelavage.Lesrésultatsobtenussontregroupésdansletableausuivant:
SangtotalNombreMoy.(%)SDCV(%)
LymphosCD3+3160,721,612,7
LIMITES
1.Lesrésultatsdecytométrieenuxpeuventêtreerronéssilecytomètren’estpasparfaitementaligné,les
fuitesdeuorescencecorrectementcompenséesetlesrégionsdeconditionnementsoigneusementplacées.
2.Onobtiendradesrésultatsprécisetreproductiblesdanslamesureoùlesprocéduresutiliséessontconformes
auxinstructionsdeschestechniquesetcompatiblesaveclesbonnespratiquesdelaboratoire.
3.Danslecasdel'hyperleucocytose,diluerlesangdansduPBSand'obtenirunevaleurd'environ5x109
leucocytes/L(7).
4.Encasdepolyglobulie,diluerlespécimendansduPBSdefaçonàobtenir5x1012globulesrouges/L(8,9,
10).
5.VersaLysedoitêtreàtempératureambiante(18–25°C)avantutilisation.
6.Vérierlespréparationsàl’œilnupourapprécierl’efcacitédelalyse.Siellessonttroublesousiles
histogrammesdesdiffractionsdelumièresontinhabituels,ilsepeutquelalysenesoitpascomplète.
7.Lesérythroblastespeuventêtreincomplète-mentlysésetapparaîtresurunhistogrammedesdiffractionsde
lumièreaumêmeendroitquelesleucocytes(11).
8.L’acétazolamide,uninhibiteurdel’anhydrasecarbonique,peutinhibertotalementl’actiondeVersaLyse(12).

B59380–AD12of135
9.Danscertainsétatspathologiques,tellesqu'unegraveinsufsancerénaleouunehémoglobinopathie,lalyse
desérythrocytespeutêtrelente,incomplèteoumêmeimpossible.Danscecas,ilestrecommandéd'isoler
lescellulesmononuclééesenutilisantungradientdedensité(Ficoll,parexemple)avantlemarquage(13).
MARQUES
BeckmanCoulter,lelogostyliséetlesmarquesdesproduitsetdesservicesBeckmanCoultermentionnéesici
sontdesmarquesoudesmarquesdéposéesdeBeckmanCoulter,Inc.auxÉtats-Unisetdansd’autrespays.
Légendedessymboles
Glossairedessymbolesdisponiblessurlapagebeckman.com/techdocs(documentnuméroB60062)

B59380–AD13of135
Spezikationen
GebrauchsfertigesVersaLyseLyselösung
FormFlüssig
Band100mL
Anzahlder
Fläschchen1Fläschchen
MengejeTest1mL(gebrauchsfertigfürAnwendungohnegleichzeitigeFixation)
VersaLyse
Lyse-Lösung
1mL/Test,A09777100Tests;100mL
In-vitro-Diagnostikum
VERWENDUNGSZWECK
DiesesReagenzdientzurLysederrotenBlutkörperchenbeiderVorbereitungbiologischerProbenzurAnalyse
imDurchusszytometer.VersaLyseistbeiallenZytometertypeneinsetzbarundwirdmitsowieohneWaschschritt
nachderInkubationangewendet,sofernuoreszierendeAntikörperverwendetwerden,dievorabordnungsgemäß
fürdasgewählteProtokollkalibriertwurden.MitVersaLysekönnenzudemProbenbehandeltwerden,auch
wenndiesezuvoreinemWaschschrittunterzogenwurden,umz.B.dieserösenImmunglobulinezueliminieren
(1,2,3,4,5).
PRINZIP
DieProbemitdenzulysierendenErythrozytenwirdmindestens10MinutenmitdemVersaLyse-Reagenzin
Kontaktgebracht.DerHauptwirkstoffvonVersaLyseisteinringförmigesAmin,dassichinKontaktmitderinden
rotenBlutkörperchenenthaltenenKohlensäureanhydrataseineinenfürdieseZellenstarklysierendenWirkstoff
verwandelt.
DiesesReagenzwirdmitspezischenkonjugiertenAntikörpernverwendet,welchedieFähigkeithaben,sich
mitHilfedervonleukozytärenZellenexprimiertenAntigendeterminantenandiesezubinden.Diespezische
MarkierungderLeukozytenerfolgtdurchInkubationderProbemitdembzw.denAntikörpern.DieErythrozyten
werdenanschließenddurcheineLyseeliminiert.DievondiesemProzessverschontenLeukozytenwerdenim
Durchusszytometeruntersucht.
DiePräparatemüssenbei2bis8°CaufbewahrtundinnerhalbkurzerZeitimDurchusszytometeranalysiert
werden.WenndieAnalyseeinpaarStundenhinausgeschobenwird,könnensiemit0,1%Formaldehyd
enthaltendemPBSxiertwerden(RichtenSiesichnachderAnleitungdesIOTest3Fixationslösung–Art.A07800
–füreinVerfahrenumeinen0,1%FormaldehydPBSzuzubereiteten).IndiesemFallisteinvorausgehender
Waschschritterforderlich.
DasDurchusszytometermisstdieLichtverteilungsowiedieFluoreszenzderZellen.Dabeiwirddie
Target-PopulationinnerhalbeinesineinemHistogrammdeniertenelektronischenFenstersuntersucht,dasdie
Seitwärtslichtstreuung("SideScatter"oderSS)sowiedieVorwärtslichtstreuung("ForwardScatter“oderFS)
wiedergibt.JenachvomBedienergewählterAnwendungsindauchandereHistogramme,diezweideram
ZytometervorhandenenParameterkombinieren,alsGrundlagezumGatinganwendbar.
DieFluoreszenzdersoabgegrenztenZellenwirdzurUnterscheidungderpositivmarkiertenEreignissevonden
nichtmarkiertenEreignissenanalysiert.DieErgebnissewerdeninProzentzahlenpositiverEreignisseinBezug
aufalleimelektronischenFensterberücksichtigtenEreignisseausgedrückt.
WARNUNGENUNDVORSICHTSMASSNAHMEN
1.DasReagenznichtüberdasHaltbarkeitsdatumhinausanwenden.
2.NichtimKühlschrankaufbewahren,nichteinfrieren.
3.WährenddesInkubierensmitdenuoreszierendenAntikörperndieLichteinstrahlungaufeinMinimum
reduzieren.
4.KontaminationdurchMikroorganismenderReagenzienvermeiden.DieskönntezufalschenErgebnissen
führen.
5.Formaldehydistgiftigundallergenisierendundwirdalskrebserregendeingestuft.NiemitdemMund
pipettierenundjeglichenKontaktmitderHaut,denSchleimhäuten,AugenundKleidungsstückenvermeiden.

B59380–AD14of135
6.JedeBlutprobemussalspotentiellinfektiösbetrachtetunddahermitdenüblichenVorsichtsmaßnahmen
gehandhabtwerden(insbesondereTragenvonHandschuhen,KittelundSchutzbrille).
7.DieBlutröhrchenunddaszurHandhabungverwendeteEinwegmaterialmüsseninzurVerbrennung
vorgesehenenadhoc-Containernentsorgtwerden.
GHS-GEFAHRSTOFFKLASSIFIZIERUNG
VersaLyse-LysierlösungACHTUNG
H315VerursachtHautreizungen.
H319VerursachtschwereAugenreizung.
P280Schutzhandschuhe,
Schutzkleidungund
Augenschutz/Gesichtsschutz
tragen.
P302+P352BEIKONTAKTMITDERHAUT:Mit
vielWasserundSeifewaschen.
P305+P351+P338BEIKONTAKTMITDENAUGEN:
EinigeMinutenlangbehutsam
mitWasserspülen.Vorhandene
KontaktlinsennachMöglichkeit
entfernen.Weiterspülen.
P332+P313BeiHautreizung:Ärztlichen
Rateinholen/ärztlicheHilfe
hinzuziehen.
P337+P313BeianhaltenderAugenreizung:
ÄrztlichenRateinholen/ärztliche
Hilfehinzuziehen.
P362+P364KontaminiertenKleidungsstücke
ausziehenundvorerneutem
Tragenwaschen.
Salzsäure0,5-1,0%
Pyrrolidin1-2%
DasSicherheitsdatenblattistauftechdocs.beckmancoulter.comverfügbar.
LAGERUNGUNDSTABILITÄT
VersaLyseistbei18bis25°Caufzubewahren.WenneinFläschchenVersaLyseversehentlichindenKühlschrank
gestelltwurde,diesesvorAnwendungmindestenseineStundebeiRaumtemperatur(18–25°C)erwärmenlassen.
UngeöffneteReagenziensindbiszumaufdemFläschchenaufgedrucktenHaltbarkeitsdatumstabil.
NachÖffnendesFläschchensbleibtdasReagenz90Tagehaltbar.
PROBEN
DieBlutabnahmenvonvenösemBlutbzw.dieKnochenmarkpunktionenmüssenmitsterilenRöhrchen
vorgenommenwerden,dieeinEDTA-SalzalsgerinnungshemmendeSubstanzenthalten.
HINWEIS:BitteaufmerksamimAbschnittANTIKOAGULANZIENdieBedingungennachlesen,unterdenenandere
Antikoagulanzienverwendetwerdenkönnen.
DieProbenmüssenbeiRaumtemperatur(18–25°C)undruhendaufbewahrtwerden.VorDurchführungdesTests
wirdempfohlen,dieProbedurchleichtesSchüttelnzuhomogenisieren.
DieProbenmüsseninnerhalbvon24StundennachderProbeentnahmeanalysiertwerden.
GEWASCHENEPROBEN
WennSiedieProbenvordemMarkierenundderLysederrotenBlutkörperchenwaschenmüssen,müssen
unbedingtnachdemletztenZentrifugierenalleÜberständeentferntwerden.ZuvielWaschpufferamZellpellet
kanndieWirksamkeitvonVersaLysereduzieren.
VORBEREITUNGDERPROBEN

B59380–AD15of135
DieLeukozytenkonzentrationinderProbemussunter104Zellen/µL(1010/L)liegen.FallserforderlichinPBS
verdünnen,umdieleukozytäreKonzentrationauf5x103/µL(5x109/l)zubringen.
DieErythrozytenkonzentrationinderProbemussunter6x106/µL(6x1012/l)liegen.Eswirdempfohlen,diesein
PBSzuverdünnen,umdieerythrozytäreKonzentrationauf5x106/µLzubringen.
WenndieLeukozyten-undErythrozyten-konzentrationenangepasstwerdenmüssen,istimmerdiestärkste
Verdünnungdurchzuführen.BeidenVerfahrenkommen100µLvorverdünntebzw.nichtverdünnteProbeje
RöhrchenzurAnwendung.
VERFALLSANZEICHEN
JeglicheVeränderungderphysikalischenEigenschaftenderReagenzienkannaufeineAlterunghinweisen,das
Reagenzsolltedannnichtmehrverwendetwerden.
ImFallevonVerpackungsschädenodereinerLeistungbeeinträchtigungdesProdukts,kontaktierenSiebitteIhren
lokalenVertrieboderbenutzenSiediefolgendee-mail:
[e-mail]
BENÖTIGTE,JEDOCHNICHTIMKITENTHALTENEARTIKEL:
•RöhrchenzurBlutabnahmeundweiteresfürdieBlutabnahmeerforderlichesMaterial.
•AutomatischePipettenundEinweghülsenzurEntnahmefolgenderMengen:10,20,100und1000µL.
•HämolyseröhrchenausKunststoff.
•Eich-Beads:Flow-SetFluorospheres(Art.6607007).
•SpezischeuoreszierendeAntikörper
•Isotypiekontrollen.
•Puffer(PBS:0,01MNatriumphosphat;0,145MNatriumchlorid;pH7,2).
•Fixationsreagenz:z.B.:IOTest3-Fixationslösung(Art.A07800).
•Zentrifuge.
•AutomatischerRüttler(TypVortex).
•Durchusszytometer.
VERFAHRENmitVERSALYSE-REAGENZ
HINWEIS:DienachfolgendenVerfahrengeltenfürStandardanwendungen.DieProbe-und/oder
VersaLyse-MengenkönnenbeieinigenBeckmanCoulter-Anwendungenabweichen.IndiesemFallsinddie
AnleitungendestechnischenDatenblattsderAnwendungzubefolgen.
A–VerfahrenohnegleichzeitigeFixation
VORBEREITUNGDESREAGENZES
KeineVorbereitungerforderlich.VersaLysedirektausdemFläschchenverwenden.
FürjedegetesteteProbezusätzlichzumTeströhrcheneinKontrollröhrchenvorsehen,indemdieZellenmitder
IsotypiekontrollederspezischangewendetenMarkierunginKontaktgebrachtwerden.
1.InjedesTeströhrchendievomHerstellerzumMarkierenvon5x105LeukozytenempfohleneMengeAntikörper
geben.
2.InjedesKontrollröhrchendievomHerstellerzumMarkierenvon5x105LeukozytenempfohleneMenge
Isotypiekontrollegeben.
3.InbeidenRöhrchen100µLderzutestendenProbe(vorverdünntbzw.nichtvorverdünnt)hinzufügen.Beide
Röhrchenleichtrütteln.
4.UnterdenimDatenblattderangewendetenAntikörpergenanntenBedingungeninkubieren.
5.1mLVersaLysehinzufügenundsofort1Sekunderütteln.
6.Mindestens10MinutenvorLichteinstrahlunggeschütztbeiRaumtemperatur(18–25°C)inkubieren.
BeieinemVerfahrenohneWaschschrittsinddieRöhrchennunzurAnalyseimZytometerbereit.
Hinweis:WenndieZubereitungengewaschenwerdenmüssen,erstanalysieren,wenndieSchritte7bis11
durchgeführtwurden.
7.5Minutenbei150xgundRaumtemperaturzentrifugieren.

B59380–AD16of135
WICHTIGERHINWEIS:Esseidaraufhingewiesen,dassbeiVerwendungdernichtbegleitenden
FixationsprozedurmiteinemWaschschrittZellendubletten,sogenannte“Escapees”,gebildetwerden
können,diemöglicherweiseaufgrundihrerLichtstreuendenEigenschaftenundaufgrundderTatsache,dass
sieandenGating-Regionenaustreten,zufehlerhaftenErgebnissenführen(6).StarkesSchüttelnkanndiese
Dublettenzerstören
8.ÜberständedurchAbsaugenentfernen.
9.Zellpelletin3mLPBSresuspendieren.
10.5Minutenbei150xgundRaumtemperaturzentrifugieren.
11.ÜberständedurchAbsaugenentfernenundZellpelletresuspendierenin:
•0,5mLoder1mLPBSplus0,1%Formaldehyd,wenndiePräparatewenigerals24Stundenerhaltenwerden
sollen.(0,1%Formaldehyd-PBSkanndurchVerdünnenvon12,5µLderIOTest3-Fixierlösung(REFA07800)
bei10xKonzentrationin1mLPBSerhaltenwerden.)
•0,5mLoder1mLPBSohneFormaldehyd,wenndieProbeninnerhalbvon2Stundengetestetwerden.
HINWEIS:InjedemFallmüssendiePräparatezwischen2und8°CundvorLichteinstrahlunggeschützt
aufbewahrtwerden.
B–VerfahrenmitgleichzeitigerFixation
VORBEREITUNGDESREAGENZES
“Fix-and-Lyse“-Mischungvorbereiten.Dazu25µLNICHTVERDÜNNTEIOTest3Fixationslösung10X*(Art.
A07800)zu1mLVersaLysehinzufügen.
3bis5Sekundenrütteln(Vortex).
(*)HINWEIS:Beider“Fix-and-Lyse“-MischungwirddieIOTest3Fixationslösung(Art.A07800)als40-fach
konzentrierteundnichtals10-fachkonzentrierte(Nennkonzentration)Lösungangewendet.
EntsprechendderzulysierendenProbenzahleineausreichendeMenge“Fix-and-Lyse“-Mischungvorbereiten(1
mLdieserMischungjeRöhrchen).
FürjedegetesteteProbezusätzlichzumTeströhrcheneinKontrollröhrchenvorsehen,indemdieZellenmitder
IsotypiekontrollederspezischangewendetenMarkierunginKontaktgebrachtwerden.
1.InjedesTeströhrchendievomHerstellerzumMarkierenvon5x105LeukozytenempfohleneMengeAntikörper
geben.
2.InjedesKontrollröhrchendievomHerstellerzumMarkierenvon5x105LeukozytenempfohleneMenge
Isotypiekontrollegeben.
3.InbeidenRöhrchen100µLderzutestendenProbe(vorverdünntbzw.nichtvorverdünnt)hinzufügen.Beide
Röhrchenleichtrütteln.
4.UnterdenimDatenblattderangewendetenAntikörpergenanntenBedingungeninkubieren.
5.1mL“Fix-and-Lyse“-Mischunghinzufügenundsofort1Sekunderütteln.
6.Mindestens10MinutenvorLichteinstrahlunggeschütztbeiRaumtemperatur(18–25°C)inkubieren.
BeieinemVerfahrenohneWaschschrittsinddieRöhrchennunzurAnalyseimZytometerbereit.
Hinweis:WenndieZubereitungengewaschenwerdenmüssen,erstanalysieren,wenndieSchritte7bis11
durchgeführtwurden.
7.5Minutenbei150xgundRaumtemperaturzentrifugieren.
8.ÜberständedurchAbsaugenentfernen.
9.Zellpelletin3mLPBSresuspendieren.
10.5Minutenbei150xgundRaumtemperaturzentrifugieren.
11.EntfernenSiedenÜberstanddurchAnsaugungundresuspendierenSiedasZellpelletin0,5mLoder1mL
PBSplus0,1%Formaldehyd,wenndiePräparatewenigerals24Stundenerhaltenwerdensollen.(0,1%
Formaldehyd-PBSkanndurchVerdünnenvon12,5µLderIOTest3-Fixierlösung(REFA07800)bei10x
Konzentrationin1mLPBSerhaltenwerden.)
Zwischen2und8°CundvorLichteinstrahlunggeschütztkönnendiesePräparate24Stundenaufbewahrt
werden.

B59380–AD17of135
ANTIKOAGULANS
EDTA-Trikaliumsalz(EDTA-K3)führtunabhängigvonderangewendetenMethodemitoderohneWaschschritt
nachderLysezudenbestenErgebnissen.
ACDundHeparinführenbeiallenVerfahrenzugutenErgebnissen,außerbeimVerfahrenohnegleichzeitige
Fixation,wennnachdiesemnocheinWaschschritterfolgt.BeidiesenAntikoagulanzienempfehlenwirdas
VerfahrenmitgleichzeitigerFixationundanschließendemWaschschritt.
ANALYSE
DieErythrozytenrestekönnenzueinemstärkerenLichtstreuungssignalandenkleinenQuadranten(“Forward
Scatter“oderFS)führenalsbeianderenhandelsüblichenLyse-reagenzien.Daherkannsichdieübliche
Einstellung(odervorgegebeneEinstellung)desDiskriminators(“threshold“)fürdiesenParameterfürVersaLyse
alszuschwacherweisen.
Eswirdalsoempfohlen,dasZytometerindenerstenMomentenderErfassungeinesStandardpräparats
einzustellen.BeilysiertemVollblutmusszumBeispielzuerstderWertdesDiskriminatorsstufenweiseerhöht
werden,bisdieleukozytärenPopulationenaufeinemFS-versus-SS-Histogrammsichtbarwerden;anschließend
mussdieVerstärkungderFS-undSS-Signalepräziseeingestelltwerden,umeineVerteilungderleukozytären
PopulationenwieaufdenAbbildungen1oder2zuerreichen.
LEISTUNG
LYMPHOZYTÄREREINHEITUNDÜBERLAPPUNG
DielymphozytäreReinheitundÜberlappungwurdegemäßdenEmpfehlungenfürCDC(1)bewertet.Von10
gesundenSpendernwurdedasmitEDTA-K3versetzteBlutmiteinerCD45-FITC-undCD14-PE-Mischung
ausmonoklonalenAntikörpernzweifachmarkiert.DiedurchschnittlicheÜberlappungundReinheitsowiedie
ExtremwertedereinzelnenVerfahrensindindenfolgendenTabellenzusammengefasst:
OhneWaschschritt
OhnegleichzeitigeFixationMitgleichzeitigerFixation
WiederndungReinheitWiederndungReinheit
96,492,396,691,6
95/97,590,1/94,395,4/98,190,1/92,6
MitWaschschritt
OhnegleichzeitigeFixationMitgleichzeitigerFixation
WiederndungReinheitWiederndungReinheit
95,694,096,297,2
95/97,390,3/97,395,4/97,592,7/99,4
REPRODUZIERBARKEITINNERHALBEINESLABORS
AmgleichenTagundamgleichenZytometerwurden31prozentualeAnalysenvonCD3+Lymphozytenan
derselbenProbe(VollbluteinesgesundenSpenders)getätigt.EswurdeeinLyseverfahrenmitgleichzeitiger
FixationundohneWaschschrittangewendet.DieerzieltenErgebnissesindinderfolgendenTabelle
zusammengefasst:
VollblutReferenznummerDurchschnitt(%)SAVK(%)
CD3+
Lymphozyten
3160,721,612,7
EINSCHRÄNKUNGEN
1.DieErgebnissederDurchusszytometriekönnenfalschsein,wenndasZytometernichtrichtigeingestellt
unddieFluoreszenzstreuungnichtrichtigkompensiertwird.AußerdemmüssendieRegionensorgfältig
angeordnetwerden.
2.GenaueundreproduzierbareErgebnissewerdenerzielt,wenndieangewendetenVerfahrendenAnleitungen
derDatenblätterundderrichtigenLaborpraxisentsprechen.
3.ImFalleeinerHyperleukozytose,verdünnenSiedasBlutinPBS,bisSieeinenWertvonca.5x109
Leukozyten/lerhalten(7).
4.BeieinerPolyglobuliedieProbeinPBSverdünnen,sodassmaneinenWertvonca.5x1012Erythrozyten/
Lerhält(8,9,10).
5.VersaLysemussvorderAnwendungaufRaumtemperatur(18–25°C)gebrachtwerden.

B59380–AD18of135
6.DiePräparatemitbloßemAugeprüfen,umdieWirksamkeitderLyseabzuschätzen.Wennsietrübsindoder
dieHistogrammederLichtstreuungenungewöhnlichsind,kannessein,dassdieLysenichtvollständigist.
7.DieErythroblastenkönnenunvollständiglysiertseinundaufeinemHistogrammderLichtstreuungan
derselbenStelleerscheinenwiedieLeukozyten(11).
8.Acetazolamid,einHemmstoffderKohlensäureanhydratase,kanndieWirkungvonVersaLysevölligaufheben
(12).
9.BeibestimmtenKrankheitsbildern,wiebeispielsweiseschweremNierenversagenoderHämoglobinopathien
kanndieLysederErythrozytenlangsam,unvollständigodergarnichtablaufen.IndiesemFallwirdempfohlen,
diemononukleärenZellenmithilfeeinesDichtegradienten(z.B.Ficoll)vordemFärbenzuisolieren(13).
HANDELSMARKEN
BeckmanCoulter,dasstilisierteLogounddieindiesemDokumenterwähntenBeckmanCoulter-Produkt-und
-DienstleistungsmarkensindindenUSAundanderenLänderneingetrageneMarkenvonBeckmanCoulter,Inc.
ListederSymbole
DasGlossarderSymboleistaufbeckman.com/techdocs(DokumentnummerB60062)verfügbar.

B59380–AD19of135
Caratteristiche
SoluzionedilisiVersaLyseprontaall’uso
FormaLiquido
Volume100mL
Numerodiaconi1acone
Volumeperprovetta1mL(prontoall’usoperprocedurasenzassaggioconcomitante)
VersaLyse
Soluzionelisante
1mL/test,A09777100test;100mL
Perusodiagnosticoinvitro
USOPREVISTO
Questoreagenteèutileainidellalisideiglobulirossidurantelapreparazionedicampionibiologiciperl’analisi
incitometriaausso.VersaLyseècompatibileconqualsiasitipodicitometroesiutilizzadopol’incubazione,con
osenzalavaggio,dianticorpiuorescentidebitamentecalibratiperilprotocolloselezionato.Icampionipossono
esseretrattaticonquestoreagenteanchedopoesserstatilavati;adesempiopereliminareleimmunoglobuline
seriche(1,2,3,4,5).
PRINCIPIO
IlcampionecontenenteleemaziedasottoporrealisièmessoinpresenzadelreagenteVersaLyseperalmeno10
minuti.IlcomponenteattivoprincipalediVersaLyseèun’amminaciclicache,acontattoconl’anidrasicarbonica
contenutanelleemazie,sitrasformainuncompostoaltamenteliticoperquestecellule.
Questoreagentesiutilizzaconanticorpiconiugatispeciciingradodissarsisualcunecelluleleucocitarie
medianteideterminantiantigenicicheesseesprimono.Lamarcaturaspecicadeileucocitiavvienetramite
l’incubazionedelcampioneconanticorpispecici.Successivamente,glieritrocitivengonoeliminatitramitelisiei
leucociti,noncoinvoltiinquestafase,vengonoanalizzatiincitometriaausso.
Ipreparatidevonoessereconservatiaunatemperaturacompresatrai2egli8°Cerapidamenteanalizzatiin
citometriaausso.Qualorasiposticipassel’analisidialcuneore,possonoesseressaticonunapiccolaquantità
diPBScontenentelo0,1%diformaldeide(PerpreparareunPBScontenentelo0,1%diformaldeide,vederela
SchedaTecnicadelaSoluzioneFissanteIOTest3–Rif.A07800).Intalcaso,ènecessariounlavaggioprima
dell’analisi.
Ilcitometroaussomisuraladiffusionedellalucenonchélauorescenzadellecellule.Questostrumentoconsente
dicircoscriverelapopolazioneinteressataall’internodiunanestradianalisiinunistogrammachecorrelala
diffusioneortogonaledellaluce("SideScatter"oSS)alladiffusioneassiale(“ForwardScatter”oFS).Gliistogrammi,
checorrelanoduedeiparametridisponibilisulcitometro,costituisconounsupportoallafasedigatinginfunzione
dell’applicazionesceltadall’utente.
Lauorescenzadellecellulecircoscrittevieneanalizzataperdistinguerelecellulemarcatedaquellenonmarcate.
Irisultatisonoespressiinpercentualedieventipositivirispettoall’insiemedeglieventiacquisitidalgating.
AVVERTENZEEPRECAUZIONI
1.Nonutilizzareilreagentedopoladatadiscadenza.
2.Nonconservarenelfrigorifero,noncongelare.
3.Ridurrealminimol’esposizioneallalucedurantel’incubazionedelcampioneconglianticorpiuorescenti.
4.Evitarelacontaminazionemicrobicadeireagentiondeevitarel’apparizionedirisultatierrati.
5.Laformaldeideètossicaeallergenica.Èunasostanzapotenzialmentecancerogena.Nonpipettareconla
boccaedevitareilcontattoconlapelle,lemucose,gliocchiegliindumenti.
6.Ognisingolocampionedisanguedeveessereconsideratopotenzialmenteinfettivoedeveesseremanipolato
seguendoleappositeprecauzionid’uso(inparticolare,siraccomandadiindossareguanti,camiceeocchiali
protettivi).
7.Leprovettedisangueeilmaterialeusaegettautilizzatoperlamanipolazionedevonoesseresmaltitiin
appositirecipientidestinatiall’incenerimento.

B59380–AD20of135
CLASSIFICAZIONEPERICOLIGHS
SoluzionelisanteVersaLyseATTENZIONE
H315Provocairritazionecutanea.
H319Provocagraveirritazioneoculare.
P280Indossareguanti/indumenti
protettivieproteggeregliocchi/il
viso.
P302+P352INCASODICONTATTOCONLA
PELLE:lavareabbondantemente
conacquaesapone.
P305+P351+P338INCASODICONTATTOCONGLI
OCCHI:sciacquareaccuratamente
perparecchiminuti.Togliere
leeventualilentiacontattose
èagevolefarlo.Continuarea
sciacquare.
P332+P313Incasodiirritazionedellapelle:
consultareunmedico.
P337+P313Sel’irritazionedegliocchipersiste,
consultareunmedico.
P362+P364Toglieretuttigliindumenti
contaminatielavarliprimadi
indossarlinuovamente.
Acidocloridrico0,5-1,0%
Pirrolidina1-2%
Laschedatecnicasullasicurezzaèdisponibilesu
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CONSERVAZIONEESTABILITÀ
VersaLysesiconservaaunatemperaturacompresatrai18ei25°C.QualoraunaconediVersaLysefossestato
inavvertitamentemessonelfrigorifero,riportarloatemperaturaambiente(18–25°C)eattenderealmenoun’ora
primadiutilizzarlo.
Ilreagenteèstabilenoalladatadiscadenzariportatasull'etichettadelacone,acondizionechequest'ultimosia
conservatochiuso.
Dopol'apertura,ilreagentemantienelasuastabilitàper90giorni.
CAMPIONI
IlsanguevenosooilmidolloosseodaanalizzaredevonoesseremessiinprovettesterilicontenentiEDTAcome
anticoagulante.
N.B.:NelparagrafoANTICOAGULANTI,leggereattentamentelecircostanzenellequalièpossibileutilizzarealtri
anticoagulanti.
Icampionivannoconservatiatemperaturaambiente(18–25°C)senzaagitare.Primadieffettuareiltest,si
raccomandadiomogeneizzareilcontenutodellaprovettaagitandolaleggermente.
Icampionidevonoessereanalizzatientro24oredalprelievo.
CAMPIONILAVATI
Primadiprocedereallamarcaturaesuccessivamenteallalisideiglobulirossi,èindispensabileeliminare
completamenteilsurnatantedopol’ultimacentrifugata.Uneccessoditamponedilavaggiosulpelletcellulare
puòridurrel’efcaciadiVersaLyse.
PREPARAZIONEDEICAMPIONI
Laconcentrazionedileucocitinelcampionedeveessereinferiorea104cellule/µL(1010/L).Senecessario,diluire
inunapiccolaquantitàdiPBSperriportarelaconcentrazioneleucocitariaa5x103/µL(5x109/L).