Sysmex Ogt cytocell multiprobe cll User manual

PI025/CE v009.00/2019-04-30 (H001 v3 / H002 v2 / H023 v3 / H024 v3 / H026 v2 / H027 v3 / H037 v2 / H039 v6 / H072 v3)

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Instructions For Use

REF: PMP 018 / PMP 017 / PMP 016 / PMP 020

Chromoprobe Multiprobe®CLL

FOR PROFESSIONAL USE ONLY

ENGLISH/FRANÇAIS/ITALIANO/DEUTSCH/ESPAÑOL

Further information available at www.cytocell.com

Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) is a technique that allows DNA

sequences to be detected on metaphase chromosomes or in interphase nuclei from

fixed cytogenetic samples. The technique uses DNA probes that hybridise to entire

chromosomes or single unique sequences, and serves as a powerful adjunct to

classic cytogenetics. Recent developments have meant that this valuable

technique can now be applied as an essential diagnostic tool in prenatal,

haematological and pathological chromosomal analysis. Target DNA, after fixation

and denaturation, is available for annealing to a similarly denatured, fluorescently

labelled DNA probe, which has a complementary sequence. Following

hybridisation, unbound and non-specifically bound DNA probe is removed and the

DNA is counterstained for visualisation. Fluorescence microscopy then allows the

visualisation of the hybridised probe on the target material.

Probe Information

Cytocell’s Chromoprobe Multiprobe®CLL has been developed to allow probes for

detecting del (6q), Trisomy 12, del (13q), del (17p), del (11q) and rearrangements

of IGH, which lead to the 14+ markers, to be applied simultaneously to a patient

sample in a single FISH reaction. The probes have been developed to give clear

results in non-dividing cells and thus maximise the information obtained from the

technique. The device can be used for initial diagnosis, to confirm findings of routine

Cytogenetics and also for monitoring the patient over time. The device also has a

probe set for t(11;14) to enable abnormal CLL patients to be distinguished from

Mantle Cell Lymphoma patients.

Probe Specification

MYB Deletion

MYB, 6q23.3, Red (5.25-8.85ng/test)

D6Z1, 6p11.1-q11.1, Green (6.85-10.3ng/test)

The MYB probe is 183kb, labelled in red, covers the entire MYB gene and a region

telomeric to the gene, 137kb beyond the marker AFMA074ZG9. The probe mix also

contains a control probe for the 6 centromere (D6Z1) labelled in green.

Chromosome 12 Enumeration

D12Z3, 12p11.1-q11.1, Red (0.28-0.47ng/test)

The Chromosome 12 Alpha Satellite Probe is a repeat sequence probe, labelled in

red, which recognises the centromeric repeat sequence D12Z3.

ATM Deletion

ATM, 11q22.3, Red (5.25-8.85ng/test)

11q12.1, Green (20.6-30.8ng/test)

The ATM probe is 182kb, labelled in red, and covers the telomeric end of the NPAT

gene and the centromeric end of the ATM gene to just beyond the D11S3347

marker. The probe mix also contains 11q12.1 control probe labelled in green,

covering a 122kb region including the SHGC-154780 marker and a 130kb region

including the SHGC-110550 marker.

IGH/BCL2 Translocation, Dual Fusion

BCL2, 18q21.33, Red (5.60-9.44ng/test)

IGH, 14q32.33, Green (13.7-20.5ng/test)

The IGH/BCL2 product consists of probes, labelled in green, covering the Constant,

J, D and Variable segments of the IGH gene, and a 585kb probe, labelled in red,

covering the BCL2 and KDSR genes.

IGH Breakapart

IGHC, 14q32.33, Red (5.25-8.85ng/test)

IGHV, 14q32.33, Green (13.7-20.5ng/test)

PI025/CE v009.00/2019-04-30 (H001 v3 / H002 v2 / H023 v3 / H024 v3 / H026 v2 / H027 v3 / H037 v2 / H039 v6 / H072 v3)

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The IGH product consists of a 176kb probe, labelled in red, covering the Constant

region of the gene and a green probe, covering a 617kb region within the Variable

segment of the gene.

P53 Deletion

P53, 17p13.1, Red (4.20-7.08ng/test)

D17Z1, 17p11.1-q11.1, Green (13.7-20.5ng/test)

The P53 probe is 161kb, labelled in red, covers the whole P53 (TP53) gene,

extending 66kb telomeric to the gene and covering a region centromeric to the

gene, to just beyond the marker D17S655. The probe mix also contains a control

probe for the 17 centromere (D17Z1) labelled in green.

IGH/CCND1 Translocation, Dual Fusion

CCND1, 11q13.3, Red (5.60-9.44ng/test)

IGH, 14q32.33, Green (13.7-20.5ng/test)

The IGH/CCND1 product consists of probes, labelled in green, covering the

Constant, J, D and Variable segments of the IGH gene, and CCND1 probes,

labelled in red. The CCND1 probe mix contains a 155kb probe centromeric to

CCND1 gene, covering a region between the D11S2663 and the D11S4095

markers, and a second probe (162kb) covering the telomeric end of CCND1 gene

and the region up to FGF3 gene.

13q14.3 Deletion

13q14.2-q14.3, Red (6.3-10.6ng/test)

13qter, 13q34, Green (24.7-36.9ng/test)

The 13q14.3 probe, labelled in red, covers the D13S319 and D13S25 markers. The

13qter subtelomere specific probe (clone 163C9), labelled in green, allows

identification of chromosome 13 and acts as a control probe.

Materials Provided

Each kit contains the following reagents, which are sufficient for either 2 (PMP 018),

5 (PMP 017) or 10 (PMP 016) patient samples*:

1. 2, 5 or 10 Chromoprobe Multiprobe®CLL devices coated with directly labelled

probes

2. 4, 7 or 12 glass slides printed with a special template

3. 500µl Hybridisation Solution (Formamide, Dextran Sulphate, SSC)

4. 1 Cytocell Slide Surface Thermometer

5. 1 Cytocell Chromoprobe Multiprobe®Hybridisation Chamber

*20 tests kit (PMP 020) is supplied as 4x5 Chromoprobe Multiprobe®devices

Warnings and Precautions

1. For in vitro diagnostic use. For professional use only.

2. Wear gloves when handling Hybridisation solution, DNA probes and DAPI

counterstain.

3. Hybridisation Solution contains formamide, which is a teratogen; do not

breathe fumes or allow skin contact. Wear gloves, a lab coat, and handle in a

fume hood. Upon disposal, flush with a large volume of water.

4. DAPI is a potential carcinogen. Handle with care; wear gloves and a lab coat.

Upon disposal, flush with a large volume of water.

5. Dispose of all hazardous materials according to your institution’s guidelines for

hazardous waste disposal.

6. Operators must be capable of visually distinguishing between red, blue and

green.

7. Failure to adhere to the protocol may affect the performance and lead to false

positive/negative results.

Storage and Handling

The Chromoprobe Multiprobe®kit should be stored at 2-8ºC until the expiry date

indicated on the kit label. Do not freeze.

Equipment and Materials Necessary but not Supplied

1. 500µl Counterstain (DAPI antifade (ES: 0.125µg/ml DAPI (4,6-diamidino-2-

phenylindole))

2. Hotplate (with a solid plate and accurate temperature control up to 80ºC).

3. Variable volume micropipettes and tips range 1µl - 200µl.

4. Water bath with accurate temperature control at 72ºC.

5. Microcentrifuge tubes (0.5ml).

6. Fluorescence microscope (Please see Fluorescence Microscope

Recommendation section).

7. Plastic or glass coplin jars.

8. Forceps.

9. Fluorescence grade microscope lens immersion oil.

10. Bench top centrifuge.

11. Fluorescence grade glass coverslips (24 x 50 mm)

12. Timer.

13. 37ºC water bath without stirrer.

Fluorescence Microscope Recommendation

Use a 100-watt mercury lamp and plan apochromat objectives x63 or x100 for

optimal visualisation. Use a triple bandpass filter DAPI/FITC/Texas Red for optimal

visualisation of the green and red fluorophores and DAPI simultaneously.

Check the fluorescence microscope before use to ensure it is operating correctly.

Use immersion oil that is suitable for fluorescence microscopy and formulated for

low autofluorescence. Avoid mixing DAPI Antifade with microscope immersion oil

as this will obscure signals. Follow manufacturers’ recommendations in regards to

the life of the lamp and the age of the filters.

Sample Preparation

The Chromoprobe Multiprobe®is designed for use on cultured peripheral blood

cells or cultured bone marrow cells fixed in Carnoy’s fixative that should be

prepared according to the laboratory or institution guidelines.

Prepare air dried samples on Cytocell Chromoprobe Multiprobe®template slides

according to Cytocell protocol below. Baking or otherwise ageing slides is not

recommended as it may reduce signal fluorescence.

Chromoprobe Multiprobe®Protocol

Please note: The probes used on the Chromoprobe Multiprobe®device are directly

labelled with fluorophores, which are light sensitive. Ensure that exposure of the

probes to laboratory lights is limited at all times (it is not necessary to work in the

dark).

1. Slide preparation

a) Clean a template slide. Soak the template slide for 2 minutes in 100%

methanol and polish dry with a clean soft tissue.

b) Establish the correct mitotic index. It is important that the intended sample has

a sufficiently high mitotic index to allow detection of chromosome

abnormalities. To check the density of the sample, using a micropipette (e.g.

a Gilson P10 or P20) pipette 4µl of the cell suspension onto one of the areas

of the spare template slide and allow to air dry. The small volume used means

that you usually have to gently touch the slide with the pipette tip to transfer

the suspension. Examine by phase contrast microscopy. If the cell density is

too high, dilute the suspension with fresh fixative. If the mitotic index is too low,

spin down the fixed cell suspension at 160xg for 10 minutes. Note the volume

of supernatant, remove, and re-suspend the cell pellet in a smaller volume of

fresh fixative. If cell sample density has been altered, spot 4µl of the

concentrated sample onto another square of your test slide and re-examine by

phase contrast microscopy.

Please Note: 50µl is the minimum volume required for the protocol.

PI025/CE v009.00/2019-04-30 (H001 v3 / H002 v2 / H023 v3 / H024 v3 / H026 v2 / H027 v3 / H037 v2 / H039 v6 / H072 v3)

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c) Quality control of samples. Samples should be examined for cytoplasm since

this will interfere with the in situ protocol. If the chromosomes appear to be

enclosed by a granular material when examined under phase contrast

microscopy, then this will compromise results. One method for reducing

cytoplasm is to spot 4µl of your sample onto the template slide and watch the

fixative as it spreads out: in the normal situation, the fixative will spread to

maximum, recede and then evaporate. To clean up any cytoplasm we have

found that effective results are achieved if a fresh drop of fixative is allowed to

fall onto the spot at the point when the spreading fixative has reached its

maximum. Allow the drop of fixative to evaporate and re-examine the spot.

d) Spotting of the slide. Pipette 4µl of cell suspension onto all 8 areas of the

template slide in a sequence of alternating squares as shown below. This will

prevent the cell spreads from interfering with each other.

e) Once the first group of drops has air-dried, spot the remaining squares with 4µl

drops in the same manner. After the slide has dried, examination of the slide

under phase contrast will reveal whether any squares have been missed. If

spots have been missed, or squares have too few cells, simply spot those

squares again: it is not necessary to re-spot a new slide. If upon examination

of the slide, a square has insufficient cells/metaphases, further drop(s) of

suspension can be added to increase the cell density.

Please note: If the metaphases appear overspread, then clean a new template

slide thoroughly in methanol and re-spot allowing every spot to dry before

proceeding to the next.

2. Preparation of the Chromoprobe Multiprobe®device and template slide

a) Ensure that the Chromoprobe Multiprobe®Hybridisation Chamber is in the

37ºC water bath and allow to equilibrate to 37ºC (+/- 1ºC). This may take up to

an hour if the water bath has been switched on from cold.

b) Mix the hybridisation solution by repeated pipetting and pre-warm a 25µl

aliquot per device to 37ºC. Also pre-warm each device by placing it on a 37ºC

hotplate, label side down. Do not touch the raised surfaces of the device.

c) Immerse template slides containing fixed samples in 2xSSC for 2 minutes at

room temperature (RT) without agitation.

d) Whilst the device is still at 37ºC, dehydrate template slides containing fixed

samples through an ethanol series (2 minutes each in 70%, 85% and 100%)

at RT, air dry and place at 37ºC hotplate to warm up.

e) Add 2µl of pre-warmed hybridisation solution to each of the eight areas on the

pre-warmed device using a P10 micropipette, while it remains on a 37ºC

hotplate.

3. Positioning of the template slide over the device

a) Carefully invert the template slide over the device such that the number 1,

which is now upside down, is located over the top right hand area of the device

(Figure 1).

Figure 1. Location of the probes on the Chromoprobe Multiprobe®CLL. To help

locate square 1, its position on the device has been marked with a coloured label.

b) Make sure that the template slide is carefully aligned with the matching areas

on the device. Carefully lower the slide over the device so that the drops of

hybridisation solution make contact with the slide. Apply gentle, even pressure

to ensure that the hybridisation solution is spread to the edges of each of the

raised areas on the device.

c) Lift the slide carefully holding the frosted end of the glass slide and invert so

that the template slide is underneath the device. Make sure the device does

not smear across the template slide as this could cause cross-contamination

of the probes.

d) Place at 37ºC (+/- 1ºC) (hotplate or incubator) for 10 minutes.

4. Instructions for use of the Cytocell Slide Surface Thermometer

a) The temperature of the 75ºC hotplate should be checked with the Cytocell

Slide Surface Thermometer before proceeding to denaturation.

b) To use the thermometer properly, place it onto the surface of the hotplate and

wait until the different segments stop changing colour. The actual temperature

is indicated by a deep aqua colour.

Please note:

c) When the segments appear granular and the colours no longer appear uniform

and regular, the thermometer should be discarded as it is exhausted. The life

span of each thermometer should, however, easily be sufficient for a ten-

device kit.

d) This thermometer is a liquid crystal device and although reusable, it must be

treated with care to ensure a reasonable life span. The thermometer must only

be used to check the temperature of a hotplate; it must not be used to monitor

the hotplate performance over time.

5. Denaturation

Please note: A PCR thermal cycler-heating block is NOT suitable for use in

place of solid bed hotplate for this procedure.

a) Transfer the slide/device sandwich to the hotplate taking particular care to hold

it level. Ensure the sample slide is in good contact with the hotplate.

b) Denature on the hotplate at 75ºC (+/- 1ºC) for 2 minutes.

6. Hybridisation

Place the slide/device sandwich in the pre-warmed Chromoprobe Multiprobe®

Hybridisation Chamber, replace the lid and float the chamber in the 37ºC (+/-

1ºC) water bath (non-stirring) overnight.

Please note:

a) Do not seal the lid on the hybridisation chamber.

b) Do not place a lid on the water bath.

c) Do not hybridise in an incubator.

d) Please ensure that the hybridisation chamber is completely dry (i.e. no

water or damp tissue inside the chamber).

The humidity inside the chamber is vital for optimal hybridisation. The

correct levels will be achieved following those steps.

7. Post-hybridisation stringent washes

Please note: Avoid processing more than two slides through the stringency

washes at any one time.

a) Remove the device carefully from the slide.

b) Immerse the slide in 0.4xSSC (pH 7.0) at 72ºC (+/- 1ºC) for 2 minutes without

agitation.

c) Drain the slide and immerse it in 2xSSC, 0.05% Tween-20 at RT (pH 7.0) for

30 seconds without agitation.

8. Mounting and visualisation of results

a) Drain the slide and apply 20µl of DAPI antifade to each end of the slide.

b) Cover with a coverslip (24x50mm), remove any bubbles and allow the colour

to develop in the dark for 10 minutes.

c) View with a fluorescence microscope.

Please note: Certain types of microscope have slide holders, which make it difficult

to view the extreme ends of the slide. If this occurs then simply turn the slide

through 180, which will help with the viewing of the slide.

Stability of Finished Slides

FISHed slides remain analysable for up to 1 month if stored in the dark at/or below

RT.

Procedural Recommendations

1. Baking or ageing of slides may reduce signal fluorescence

2. Hybridisation conditions may be adversely affected by the use of reagents

other than those provided or recommended by Cytocell Ltd.

3. Use a calibrated thermometer for measuring temperatures of solutions,

waterbaths and incubators as these temperatures are critical for optimum

product performance.

4. The wash concentrations, pH and temperatures are important as low

stringency can result in non-specific binding of the probe and too high

stringency can result in a lack of signal.

5. Incomplete denaturation can result in lack of signal and over denaturation can

also result in non-specific binding.

6. Over hybridisation can result in additional or unexpected signals.

7. Users should optimise the protocol for their own samples prior to using the test

for diagnostic purposes.

8. Slides should be independently scored by two analysts.

9. Suboptimal conditions may result in non-specific binding that may be

misinterpreted as a probe signal.

Expected Results

MYB Deletion

In a normal cell there should be two red and two green signals (2R, 2G) whilst a

cell with a MYB deletion should have one red and two green signals (1R, 2G).

Chromosome 12 Enumeration

In a normal cell two red signals should be observed (2R). In a cell with trisomy 12

there should be three red signals (3R).

ATM Deletion

In a normal cell there should be two red and two green signals (2R, 2G) whilst a

cell with an ATM deletion should have one red and two green signals (1R, 2G).

IGH/BCL2 Translocation, Dual Fusion

In a normal cell these probes should appear as discrete red and green spots, one

for each homologue (resulting in a 2R, 2G conformation). In a t(14;18)(q32.3;q21)

patient there should be two yellow fusion signals in addition to the red and green

signals of the normal chromosomes 18 and 14 respectively (1R, 1G, 2Y).

PI025/CE v009.00/2019-04-30 (H001 v3 / H002 v2 / H023 v3 / H024 v3 / H026 v2 / H027 v3 / H037 v2 / H039 v6 / H072 v3)

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IGH Breakapart

In a normal cell two red/green (or fused yellow) signals are expected (2Y). In a cell

with monoallelic IGH translocation there should be one distinct red and one green

signal in addition to one red/green (or fused yellow) signal of the normal

chromosome 14 (1R, 1G, 1Y). In the event of a biallelic translocation no fused

signals would be present, two distinct red and two green signals should be

observed (2R, 2G).

P53 Deletion

In a normal cell there should be two red and two green signals (2R, 2G) whilst a

cell with a P53 deletion should have one red and two green signals (1R, 2G).

IGH/CCND1 Translocation, Dual Fusion

In a normal cell these probes should appear as discrete red and green spots, one

for each homologue (resulting in a 2R, 2G conformation). In a t(11;14)(q13;q32.3)

patient there should be two yellow fusion signals in addition to the red and green

signals of the normal chromosomes 11 and 14 respectively (1R, 1G, 2Y).

13q14.3 Deletion

In a normal cell there should be two red and two green signals (2R, 2G). A cell with

a hemizygous deletion of the 13q14.3 should have one red and two green signals

(1R, 2G) whilst a cell with a homozygous deletion should have no red and two

green signals (0R, 2G).

Limitations

Reporting and interpretation of FISH results should be consistent with

professional standards of practice and should take into consideration other clinical

and diagnostic information. This kit is intended as an adjunct to other diagnostic

laboratory tests and therapeutic action should not be initiated on the basis of the

FISH result alone.

Failure to adhere to the protocol may affect the performance and lead to false

positive/negative results.

This kit has not been validated for purposes outside of the intended use stated.

Additional Information

For additional product information please contact the Cytocell Technical Support

Department.

T: +44 (0)1223 294048

E: techsupport@cytocell.com

W: www.cytocell.com

FRANÇAIS

Introduction

L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) est une technique qui permet de détecter des

séquences ADN sur les chromosomes en métaphase ou sur les noyaux interphasiques

d’échantillons cytogénétiques fixés cultivés ou non cultivés. La technique utilise des sondes ADN

qui s’hybrident aux chromosomes entiers ou à des séquences spécifiques, et sert de test

complémentaire à la cytogénétique classique. De récents développements ont démontré que

cette technique informative peut maintenant être utilisée comme un outil diagnostic essentiel lors

de l’analyse des chromosomes en prénatal, hématologie et pathologie. L’ADN cible, après

fixation, est traité par la chaleur et à la formamide pour dénaturer la double hélice, la rendant

simple hélice. L’ADN cible est alors disponible pour hybridation avec une sonde ADN

complémentaire simple brin, dénaturée de la même manière et marquée avec un fluorochrome.

Après l’hybridation, l’ADN non hybridé et l’ADN non lié spécifiquement sont éliminés par une

série de lavages stringents et l’ADN est ensuite contre-coloré. Un microscope à fluorescence

permet ensuite la visualisation de la sonde hybridée sur l’ADN cible.

Informations sur les sondes

Le panel Chromoprobe Multiprobe®CLL de Cytocell a été développé pour permettre l’application

simultanée de sondes détectant la monosomie (6q), la trisomie 12, la monosomie (13q), la

monosomie (17p), la monosomie (11q) et les réarrangements du gène IGH, conduisant aux

marqueurs 14+, sur un échantillon de patient lors d’une réaction FISH unique. Les sondes ont

été développées afin de fournir des résultats clairs dans des cellules non-mitotiques et par

conséquent optimiser au maximum les informations obtenues grâce à cette technique. Le

dispositif peut être utilisé pour un diagnostic initial, aux fins de confirmer les résultats obtenus

par analyse cytogénétique de routine, ainsi que pour surveiller le patient au fil du temps. Le

dispositif possède également un jeu de sondes pour la translocation t(11;14) afin de permettre

la distinction entre les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique (LCC) anormaux et

les patients atteints de lymphomes à cellules du manteau.

Caractéristiques de la sonde

MYB Deletion

Sonde de la région MYB 6q23.3 en rouge (5.25-8.85ng/test)

Sonde de la région D6Z1 6p11.1-q11.1 en vert (6.85-10.3ng/test)

La sonde MYB de 183kb, marquée en rouge, couvre l’entièreté du gène MYB et une région

télomérique du gène s’étendant sur 137kb au-delà du marqueur AFMA074ZG9. Le mélange de

sondes contient également une sonde de contrôle du centromère du chromosome 6 (D6Z1)

marquée en vert.

Chromosome 12 Enumeration

Sonde de la région D12Z3, 12p11.1-q11.1, en rouge (0.28-0.47ng/test)

La sonde alpha-satellite du chromosome 12 est une sonde contenant une séquence répétée,

marquée en rouge, reconnaissant la séquence répétée centromérique D12Z3.

ATM Deletion

Sonde de la région ATM 11q22.3 en rouge (5.25-8.85ng/test)

Sonde de la région 11q12.1 envert (20.6-30.8ng/test)

La sonde ATM de 182kb, marquée en rouge, couvre l'extrémité télomérique du gène NPAT et

l'extrémité centromérique du gène ATM, tout juste jusqu'au-delà du marqueur D11S3347. Le

mélange de sondes contient également une sonde de contrôle 11q12.1 étiquetés en vert,

couvrant une 122Kb région, y compris le marqueur CGS-154 780 et une région 130kb Y compris

le marqueur SHGC-110550.

IGH/BCL2 Translocation, Dual Fusion

Sonde de la région BCL2 18q21.33 en rouge (5.60-9.44ng/test)

Sonde de la région IGH 14q32.33 en vert (13.7-20.5ng/test)

Le produit IGH/BCL2 se compose de sondes, marquées en vert, couvrant les segments

constants, J, D et variables du gène IGH et d’une sonde de 585kb, marquée en rouge, couvrant

les gènes BCL2 et KDSR.

IGH Breakapart

Sonde de la région IGHC 14q32.33 en rouge (5.25-8.85ng/test)

Sonde de la région IGHV 14q32.33 en vert (13.7-20.5ng/test)

Le produit IGH se compose d'une sonde de 176kb, marquée en rouge, couvrant la région

constante du gène, et d'une sonde verte, couvrant une région de 617kb située dans le segment

variable du gène.

P53 Deletion

Sonde de la région P53 17p13.1 en rouge (4.20-7.08ng/test)

Sonde de la région D17Z1 17p11.1-q11.1 en vert (13.7-20.5ng/test)

La sonde P53 de 161kb, marquée en rouge, couvre l’entièreté du gène P53 (TP53), s'étendant

sur une région télomérique de 66kb du gène et couvrant une région centromérique du gène, tout

juste jusqu'au-delà du marqueur D17S655. Le mélange de sondes contient également une sonde

de contrôle du centromère du chromosome 17 (D17Z1) marquée en vert.

IGH/CCND1 Translocation, Dual Fusion

Sonde de la région CCND1 (BCL1) 11q13.3 en rouge (5.60-9.44ng/test)

Sonde de la région IGH 14q32.33 en vert (13.7-20.5ng/test)

Le produit IGH/CCND1 se compose de sondes, marquées en vert, couvrant les segments

constants, J, D et variables du gène IGH et des sondes CCND1, marquées en rouge. Le mélange

de sondes CCND1 contient une sonde centromérique de 155kb du gène CCND1, couvrant une

région entre les marqueurs D11S2663 et D11S4095, et une seconde sonde (162kb) couvrant

l'extrémité télomérique du gène CCND1 et la région s’étendant jusqu'au gène FGF3.

13q14.3 Deletion

Sonde de la région 13q14.2-q14.3 en rouge (6.3-10.6ng/test)

Sonde de la région 13qter 13q34 en vert (24.7-36.9ng/test)

La sonde 13q14.3, marquée en rouge, couvre les marqueurs D13S319 et D13S25. La sonde

spécifique du subtélomère 13qter (clone 163C9), marquée en vert, permet l'identification du

chromosome 13 et fonctionne comme une sonde de contrôle.

Conditionnement

Chaque trousse contient les réactifs nécessaires pour tester 2 (PMP 018), 5 (PMP 017) ou 10

(PMP 016) échantillons de patient :

1. 2, 5 ou 10 dispositifs Chromoprobe Multiprobe®CLL coatés avec des sondes directement

marquées

2. 4, 7 ou 12 lames en verre imprimées avec un motif particulier.

3. 500µl de solution d'hybridation (formamide, sulfate de dextrane, SSC)

4. 1 thermomètre de surface (Cytocell Slide Surface Thermometer)

5. 1 chambre d’hybridation Cytocell Chromoprobe Multiprobe®

La trousse de 20 tests (PMP 020) est fournie sous forme de 4x5 dispositifs Chromoprobe

Multiprobe®.

Avertissements et précautions

1. Pour des applications de diagnostic in vitro. Pour une utilisation professionnelle

uniquement.

2. Portez des gants lors de la manipulation de la solution d'hybridation, des sondes DNA et

de contre-colorant DAPI.

3. La solution d'hybridation contient du formamide, qui est tératogène. N'inhalez pas les

vapeurs et évitez tout contact avec la peau. Portez des gants et une blouse de laboratoire,

et manipulez sous une hotte. Lors de la mise au rebut, rincez avec une grande quantité

d'eau.

4. Le DAPI est potentiellement cancérigène. Manipulez-le avec précaution; portez des gants

et une blouse de laboratoire. Lors de la mise au rebut, rincez avec une grande quantité

d'eau.

5. Mettez au rebut toutes les matières dangereuses conformément aux directives de votre

institution en matière de mise au rebut des déchets dangereux.

6. Visuellement, les opérateurs doivent être en mesure de faire la différence entre le rouge,

le bleu et le vert.

7. Si le protocole n’est pas respecté, la performance peut être affectée et des résultats

erronés/positifs/négatifs peuvent être obtenus.

Conservation et manipulation

La trousse Chromoprobe Multiprobe®doit être conservée entre 2 et 8ºC jusqu'à la date de

péremption indiquée sur l’étiquette de la trousse. Ne pas congeler.

Équipement et matériaux nécessaires mais non fournis

1. 500µl de contre-colorant (DAPI antifade (ES: 0,125µg/mL DAPI (4,6-diamidino-2-

phénylindole))).

2. Plaque chauffante (avec bloc et contrôle de la température jusqu’à 80ºC).

3. Micropipettes 1µl - 200µl.

4. Bain-marie avec contrôle de la température à 72ºC.

5. Tubes à microcentrifugation (0.5ml).

6. Microscope à fluorescence (Voir la section Microscope et filtres).

7. Jarres en plastique ou en verre.

8. Forceps.

9. Huile à immersion pour microscope à fluorescence.

10. Centrifugeuse de paillasse.

11. Lamelles en verre pour fluorescence (24 x 50mm).

12. Chronomètre.

13. Bain-marie à 37ºC sans agitateur.

Microscope et filtres

Utilisez une lampe au mercure de 100-watts et planifiez des objectifs apochromatiques de x63

ou x100 pour une visualisation optimale. Utilisez un filtre passe-bande triple DAPI/FITC/Texas

Red pour une visualisation optimale et simultanée des fluorophores verts et rouges et DAPI.

Contrôlez le microscope à fluorescence avant toute utilisation pour vous assurer qu'il fonctionne

correctement. Utilisez une huile d'immersion appropriée pour la microscopie à fluorescence et

formulée pour l'autofluorescence faible. Évitez de mélanger la solution DAPI Antifade avec de

l'huile d'immersion pour microscope, car cela assombrit les signaux. Suivez les

recommandations du fabricant relatives à la durée de vie de la lampe et des filtres.

Préparation des échantillons

Le panel Chromoprobe Multiprobe®est conçu pour une utilisation sur des cellules de sang

périphérique ou de moelle osseuse, cultivées et fixées avec le fixateur de Carnoy, qui doivent

être préparées selon les protocoles en vigueur dans le laboratoire ou l’établissement.

Préparer les échantillons séchés à l’air sur les lames échantillons Cytocell Chromoprobe

Multiprobe® selon le protocole Cytocell ci-dessous. La cuisson ou le vieillissement des lames

n’est pas recommandé, ceci pouvant réduire l’intensité du signal fluorescent.

Protocole Chromoprobe Multiprobe®

Remarque : les sondes utilisées pour le dispositif Chromoprobe Multiprobe®sont directement

marquées avec des fluorophores photosensibles. S'assurer que l’exposition des sondes aux

PI025/CE v009.00/2019-04-30 (H001 v3 / H002 v2 / H023 v3 / H024 v3 / H026 v2 / H027 v3 / H037 v2 / H039 v6 / H072 v3)

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lumières du laboratoire est limitée en permanence (il n'est pas nécessaire de travailler dans

l’obscurité).

1. Préparation des lames

a) Nettoyage d’une lame échantillon. Plonger la lame échantillon dans un bain méthanol

100% pendant 2 minutes et sécher avec un tissu doux.

b) Définir l’index mitotique correct. Il est important que l’échantillon ait un index mitotique

élevé afin de permettre la détection d’anomalies chromosomiques. Pour vérifier la densité

de l’échantillon, utiliser une micropipette (par exemple, Gilson P10 ou P20), pipeter 4μl de

suspension cellulaire et déposer sur l’une des surfaces de la lame échantillon de réserve,

puis laisser sécher à l’air. Vu le petit volume utilisé, vous devez généralement toucher

légèrement la lame avec l’embout de la pipette pour transférer la suspension. Examiner

avec un microscope à contraste de phase. Si la densité cellulaire est trop élevée, diluer la

suspension avec du fixateur frais. Si l’index mitotique est trop faible, centrifuger la

suspension de cellules fixées à 160g pendant 10 minutes. Noter le volume de surnageant,

éliminer le et resuspendre le culot cellulaire dans un plus faible volume de fixateur frais. Si

la densité de l’échantillon cellulaire a été modifiée, déposer 4µl de l’échantillon concentré

sur une autre case de votre lame d’essai, et vérifier de nouveau au microscope à contraste

de phase.

Remarque : un volume minimum de 50μl est requis par le protocole.

c) Contrôle de la qualité des échantillons. Les échantillons doivent être examinés afin de

s’assurer de l’absence de cytoplasme, celui-ci pouvant perturber le protocole in situ. Si les

chromosomes semblent être enveloppés par une substance granulaire lors de l’examen

au microscope à contraste de phase, les résultats seront compromis. Une méthode pour

réduire le cytoplasme consiste à déposer 4μl d’échantillon sur la lame échantillon et

observer la façon dont le fixateur s’étale. Normalement, le fixateur s’étale au maximum, se

rétracte, puis s’évapore. Pour éliminer le cytoplasme, nous avons constaté que des

résultats efficaces sont obtenus si l’on dépose une goutte de fixateur frais sur le dépôt

lorsque l’étalement du fixateur est maximal. Laisser la goutte de fixateur s’évaporer et

examiner de nouveau le dépôt.

d) Dépôt sur lalame. Pipeter et déposer 4µl de suspension cellulaire sur chacune des 8 cases

de la lame échantillon, selon un motif en quinconce comme illustré ci-dessous. Ceci évitera

que les gouttes de suspension cellulaire interfèrent entre elles lors de leur étalement.

e) Lorsque le premier groupe de gouttes a séché, déposer de la même façon 4μl de

suspension cellulaire dans les cases restantes. Lorsque la lame est sèche, un examen de

la lame en contraste de phase permettra de s’assurer qu’aucune case n’a été oubliée. S’il

manque des gouttes, ou si des cases comportent trop peu de cellules, redéposer

simplement d’autres gouttes sur ces cases. Il n'est pas nécessaire de repréparer une

nouvelle lame. Si après examen de la lame, une case ne présente pas suffisamment de

cellules/métaphases, il est possible de redéposer d’autres gouttes de suspension afin

d’augmenter la densité cellulaire.

Remarque : si les métaphases semblent sur-étalées, nettoyer complètement une nouvelle lame

échantillon dans du méthanol et effectuer un nouveau dépôt, puis laisser sécher chaque goutte

avant de passer au dépôt suivant.

2. Préparation du dispositif Chromoprobe Multiprobe®et de la lame échantillon

a) Vérifier que la chambre d’hybridation Chromoprobe Multiprobe®se trouve dans un bain-

marie à 37ºC et laisser équilibrer à 37ºC (+/- 1ºC). Ceci peut prendre jusqu'à une heure au

maximum si le bain-marie était froid au départ.

b) Mélanger la solution d'hybridation en pipetant plusieurs fois et préchauffer un aliquote de

25µl par dispositif à 37ºC. Préchauffer également chaque dispositif en le plaçant sur une

plaque chauffante à 37ºC et en vérifiant que l’étiquette est placée au-dessous. Ne pas

toucher les surfaces hautes du dispositif.

c) Plonger les lames comportant les échantillons fixés dans du tampon 2xSSC pendant

2 minutes, à température ambiante sans agitation.

d) Alors que le dispositif est toujours à 37ºC, déshydrater les lames comportant les

échantillons fixés dans une série de bains d’éthanol (2 minutes dans chaque bain, 70%,

85% et 100%) à température ambiante, laisser sécher à l’air et placer sur la plaque

chauffante à 37ºC pour démarrer.

e) Ajouter 2µl de solution d'hybridation préchauffée sur chacune des 8 cases du dispositif

préchauffé à l'aide d’une micropipette P10 pendant que celui-ci est encore sur la plaque

chauffante à 37ºC.

3. Positionnement de la lame échantillon sur le dispositif

a) Retourner délicatement la lame échantillon sur le dispositif, de telle sorte que la case

numéro 1, qui est à présent inversée, soit positionnée en haut et à droite du dispositif

(figure 1).

Figure 1. Emplacement des sondes sur le dispositif Chromoprobe Multiprobe®CLL. Pour

faciliter la localisation de la case 1, sa position sur le dispositif a été marquée avec une étiquette

de couleur.

b) Veillez à ce que la lame échantillon soit bien alignée sur les cases complémentaires du

dispositif. Appliquer délicatement la lame sur le dispositif afin que les gouttes de solution

d'hybridation entrent en contact avec la lame. Appuyer légèrement en exerçant la même

pression, afin de garantir que la solution d'hybridation est étalée sur les bords de chacune

des surfaces hautes du dispositif.

c) Soulever délicatement la lame en tenant l’extrémité dépolie de la lame de verre et retourner

afin que la lame échantillon soit en dessous du dispositif. S'assurer que le dispositif ne

glisse pas sur la lame échantillon, car ceci pourrait entraîner des contaminations croisées

entre les sondes.

d) Placer à 37ºC (+/- 1ºC) (plaque chauffante ou incubateur) pendant 10 minutes.

4. Mode d'emploi du thermomètre Cytocell Slide Surface Thermometer

a) La température de la plaque chauffante (75ºC) doit être vérifiée avec le thermomètre

Cytocell Slide Surface Thermometer avant de procéder à l’étape de dénaturation.

b) Pour utiliser le thermomètre correctement, le placer sur la surface de la plaque chauffante

et attendre que les différents segments cessent de changer de couleur. La bonne

température est indiquée par une couleur vert opale.

Remarque :

c) Si les segments apparaissent granuleux et de couleur non uniforme et non régulière, le

thermomètre doit être jeté, car il est usé. Toutefois, la durée de vie de chaque thermomètre

devrait être bien suffisante pour l’utilisation d’une trousse de 10 tests.

d) Ce thermomètre est un dispositif à cristaux liquides et bien que réutilisable, il doit être

manipulé avec précaution pour garantir une durée de vie raisonnable. Le thermomètre ne

doit être utilisé que pour vérifier la température d’une plaque chauffante ; il ne doit pas être

utilisé pour surveiller le fonctionnement de la plaque chauffante à mesure que le temps

passe.

5. Dénaturation

Remarque : un bloc chauffant de thermocycleur PCR NE peut PAS être utilisé pour remplacer

une plaque chauffante en lit fixe pour ce protocole.

a) Transférer l’ensemble lame/dispositif sur la plaque chauffante en faisant bien attention de

la maintenir horizontalement. S’assurer que la lame échantillon est bien en contact avec

la plaque chauffante.

b) Dénaturer sur la plaque chauffante à 75ºC (+/- 1ºC) pendant 2 minutes.

6. Hybridation

Placer l’ensemble lame/dispositif dans la chambre d’hybridation Chromoprobe Multiprobe®,

remettre le couvercle et laisser flotter la chambre dans un bain-marie à 37ºC (+/- 1ºC) (sans

agitation) pendant une nuit.

Remarque :

a) Ne pas sceller le couvercle de la chambre d’hybridation.

b) Ne pas placer un couvercle sur le bain-marie.

c) Ne pas hybrider dans un incubateur.

d) Veuillez vous assurer que la chambre d’hybridation est bien sèche (c’est-à-dire, aucune

eau ou tissu humide à l’intérieur de la chambre).

L’humidité à l'intérieur de la chambre est cruciale pour une hybridation optimale. Les

taux corrects seront obtenus en suivant ces étapes.

7. Lavages stringents de post-hybridation

Remarque : éviter de traiter plus de 2 lames à la fois lors de l’étape de lavages stringents.

a) Retirer délicatement le dispositif de la lame.

b) Plonger la lame dans un tampon 0,4xSSC (pH 7,0) à 72ºC (+/- 1ºC) pendant 2 minutes,

sans agitation.

c) Égoutter la lame et la plonger dans un tampon 2xSSC, Tween-20 à 0,05% à température

ambiante (pH7,0) pendant 30 secondes, sans agitation.

8. Montage et visualisation des résultats

a) Égoutter la lame et déposer 20µl de DAPI antifade sur chaque extrémité de la lame.

b) Couvrir avec une lamelle (24 x 50mm), éliminer toute bulle et laisser la couleur se

développer dans l’obscurité pendant 10 minutes.

c) Visualiser avec un microscope à fluorescence.

Remarque : certains types de microscope sont équipés de porte-lame, ce qui peut compliquer

la visualisation des extrémités de la lame. Si c’est le cas, tourner simplement la lame de 180°

pour en faciliter la vue.]

Stabilité des lames

Les lames FISH sont analysables pendant un mois si elles sont conservées à l’obscurité et à/ou

au-dessous de la température ambiante.

Recommandations

1. La cuisson ou le vieillissement des diapositives peut réduire la fluorescence du signal.

2. Les conditions d'hybridation peuvent être affectées négativement si des réactifs autres

que ceux fournis ou recommandés par Cytocell Ltd. sont utilisés.

3. Utilisez un thermomètre étalonné pour mesurer les températures des solutions, des bains

d’eau et des incubateurs, car ces températures sont essentielles à la performance

optimale du produit.

4. La concentration, le pH et la température de la solution de rinçage sont importants car une

faible stringence peut entraîner une liaison non spécifique de la sonde et une stringence

trop élevée peut entraîner une absence de signal.

5. Une dénaturation incomplète peut entraîner une absence de signal et une dénaturation

trop élevée peut entraîner également une liaison non spécifique.

6. Une dénaturation trop élevée peut générer des signaux supplémentaires ou inattendus.

7. Avant toute utilisation du test à des fins de diagnostic, les utilisateurs devront optimiser le

protocole pour leurs propres échantillons.

8. Les diapositives devront être notées indépendamment par deux analystes.

9. Des conditions sous-optimales peuvent entraîner une liaison non spécifique susceptible

d'être interprétée comme un signal de la sonde.

Résultats attendus

MYB Deletion

Dans une cellule normale, deux signaux rouges et verts (2R, 2V) doivent être observés alors

qu'une cellule comportant une délétion MYB doit présenter un signal rouge et deuxsignaux verts

(1R, 2V).

Chromosome 12 Enumeration

Dans une cellule normale, deux signaux rouges doivent être observés (2R). Dans une cellule

présentant une trisomie 12, trois signaux rouges doivent être observés (3R).

ATM Deletion

Dans une cellule normale, deux signaux rouges et verts (2R, 2V) doivent être observés alors

qu'une cellule comportant une délétion ATM doit présenter un signal rouge et deux signaux verts

(1R, 2V).

PI025/CE v009.00/2019-04-30 (H001 v3 / H002 v2 / H023 v3 / H024 v3 / H026 v2 / H027 v3 / H037 v2 / H039 v6 / H072 v3)

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IGH/BCL2 Translocation, Dual Fusion

Dans une cellule normale, ces sondes apparaissent comme des points rouges et verts discrets,

un pour chaque chromosome homologue (entraînant une conformation 2R, 2V). Chez un patient

t(14;18)(q32.3;q21), deux signaux de fusion jaunes devraient être observés en plus des signaux

rouges et verts des chromosomes normaux 18 et 14 respectivement (1R, 1V, 2J).

IGH Breakapart

Dans une cellule normale, deux signaux rouges/verts (ou de fusion jaunes) sont attendus (2J).

Dans une cellule comportant une translocation IGH monoallélique, un signal rouge distinct et un

signal vert doivent être observés en plus d'un signal rouge/vert (ou de fusion jaune) du

chromosome 14 normal (1R, 1V, 1J). Dans le cas d'une translocation biallélique, aucun signal

de fusion n'est présent, deux signaux rouges et deux signaux verts distincts doivent être

observés (2R, 2V).

P53 Deletion

Dans une cellule normale, deux signaux rouges et verts (2R, 2V) doivent être observés alors

qu'une cellule comportant une délétion P53 doit présenter un signal rouge et deux signaux verts

(1R, 2V).

IGH/CCND1 Translocation, Dual Fusion

Dans une cellule normale, ces sondes apparaissent comme des points rouges et verts discrets,

un pour chaque chromosome homologue (entraînant une conformation 2R, 2V). Chez un patient

t(11;14)(q13;q32.3), deux signaux de fusion jaunes devraient être observés en plus des signaux

rouges et verts des chromosomes normaux 11 et 14 respectivement (1R, 1V, 2J).

13q14.3 Deletion

Une cellule normale doit présenter deux signaux rouges et deux signaux verts (2R, 2V). Une

cellule comportant une délétion hémizygote de 13q14.3 doit présenter un signal rouge et deux

signaux verts (1R, 2V) alors que deux signaux verts, sans aucun signal rouge, (0R, 2V) doivent

être observés pour une cellule comportant une délétion homozygote.

Limitations

Le signalement et l'interprétation des résultats FISH doivent être conformes aux normes de

pratique professionnelle et doivent tenir compte des autres informations cliniques et

diagnostiques. Ce kit tient lieu de succédané aux autres tests diagnostics de laboratoire et

aucune action thérapeutique ne doit être initiée sur la base des résultats FISH uniquement.

Si le protocole n’est pas respecté, la performance peut être affectée et des résultats

erronés/positifs/négatifs peuvent être obtenus.

Ce kit n'a pas été validé pour une utilisation en dehors du cadre prévu et indiqué.

Informations supplémentaires

Pour plus d’informations sur le produit, veuillez contacter l’Assistance technique Cytocell.

T: +44 (0)1223 294048

E: [email protected]

W: www.cytocell.com

ITALIANO

Introduzione

L'ibridazione in situ in fluorescenza (Fluorescence In Situ Hybridisation - FISH) è una tecnica che

permette di rilevare sequenze di DNA su cromosomi in metafase o in nuclei in interfase di

campioni citogenetici fissati, o in coltura dopo prelievo. La tecnica prevede l'utilizzo di sonde di

DNA in grado di ibridare con l'intero cromosoma o con singole sequenze. La FISH costituisce

quindi un potente strumento in aggiunta alle tecniche citogenetiche classiche. Recenti sviluppi

hanno reso possibile che questa preziosa tecnica può ora essere applicata come strumento

diagnostico essenziale nell’analisi cromosomica prenatale, ematologia e patologica. Il DNA

bersaglio, dopo la fissazione, è sottoposto a denaturazione al calore in presenza di formamide.

Il DNA bersaglio è così disponibile per l’annealing con una sonda di DNA a singola elica a

sequenza complemetare, marcata con una sostanza fluorescente. Terminata l’ibridazione, la

sonda di DNA non legata o legata in modo non specifico, è rimossa per mezzo di lavaggi

stringenti ed il DNA è in seguito colorato con un colorante di contrasto. L’ibridazione della sonda

viene infine analizzata con un microscopio a fluorescenza.

Informazioni sulle sonde

Chromoprobe Multiprobe ®CLL Cytocell è stata sviluppata per consentire alle sonde di rilevare

del (6q), trisomia 12, del (13q), del (17p), del (11q) e riarrangiamenti di IGH, il che porta a

marcatori 14+, da applicare contemporaneamente a un campione di paziente in una singola

reazione FISH. Le sonde sono state sviluppate per dare risultati chiari in cellule che non si

dividono e portare così al massimo le informazioni ricevute dalla tecnica. Il dispositivo può essere

utilizzato per diagnosi iniziale, per la conferma di risultati di citogenetica di routine e anche per

monitorare il paziente nel tempo. Il dispositivo ha anche un set di sonde per t(11;14) per

consentire ai pazienti con anomalia CLL di essere distinti da pazienti con linfoma mantellare.

Specifiche della sonda

Regione MYB, 6q23.3 rosso (5.25-8.85ng/test)

Regione D6Z1, 6p11.1-q11.1 verde (6.85-10.3ng/test)

La sonda MYB è di 183kb, marcata in rosso, copre tutto il gene MYB e una regione telomerica

rispetto al gene, 137kb oltre il marcatore AFMA074ZG9. Il mix della sonda contiene anche una

sonda di controllo per il centromero 6 (D6Z1), marcata in verde.

Chromosome 12 Enumeration

Regione D12Z3, 12p11.1-q11.1 rosso (0.28-0.47ng/test)

La sonda alfa satellite per il cromosoma 12 è una sonda a sequenza ripetuta, marcata in rosso,

che riconosce la sequenza centromerica ripetuta D12Z3.

ATM Deletion

Regione ATM, 11q22.3 rosso (5.25-8.85ng/test)

Regione 11q12.1 verde (20.6-30.8ng/test)

La sonda ATM è lunga 182kb, marcata in rosso, e copre l'estremità telomerica del gene NPAT e

l'estremità centromerica del gene ATM subito oltre il marcatore D11S3347. Il mix della sonda

contiene 11q12.1 sonda di controllo marcata in verde, che copre una zona di 122kb compreso il

marcatore SHGC-154780 e una Regione 130kb compreso il marcatore SHGC-110550.

IGH/BCL2 Translocation, Dual Fusion

Regione BCL2, 18q21.33 rosso (5.60-9.44ng/test)

Regione IGH, 14q32.33 verde (13.7-20.5ng/test)

Il prodotto IGH/BCL2 è costituito da sonde, marcate in verde, che coprono i segmenti costante,

J, D e variabile del gene IGH e da una sonda di 585kb, marcata in rosso, che copre i geni BCL2

e KDSR.

IGH Breakapart

Regione IGHC, 14q32.33 rosso (5.25-8.85ng/test)

Regione IGHV, 14q32.33 verde (13.7-20.5ng/test)

Il prodotto IGH è costituito da una sonda di 176kb, marcata in rosso, che copre la regione

costante del gene, e da una sonda verde, che copre una regione di 617kb all'interno del

segmento variabile del gene.

P53 Deletion

Regione P53, 17p13.1 rosso (4.20-7.08ng/test)

Regione D17Z1, 17p11.1-q11.1 verde (13.7-20.5ng/test)

La sonda P53 è di 161kb, marcata in rosso, copre tutto il gene P53 (TP53), con una lunghezza

di 66kb telomerica rispetto al gene e copre una regione centromerica rispetto al gene, fino a

subito oltre il marcatore D17S655. Il mix della sonda contiene anche una sonda di controllo per

il centromero 17 (D17Z1), marcata in verde.

IGH/CCND1 Translocation, Dual Fusion

Regione CCND1 (BCL1), 11q13.3 rosso (5.60-9.44ng/test)

Regione IGH, 14q32.33 verde (13.7-20.5ng/test)

Il prodotto IGH/CCND1 è costituito da sonde, marcate in verde, che copronoi segmenti costante,

J, D e variabile del gene IGH e da sonde CCND1, marcate in rosso. Il mix della sonda CCND1

contiene una sonda di 155kb centromerica rispetto al gene CCND1, che copre una regione tra i

marcatori D11S2663 e D11S4095e una seconda sonda (162kb) che coprel'estremità telomerica

del gene CCND1 e la regione fino al gene FGF3.

13q14.3 Deletion

Regione 13q14.2-q14.3, rosso (6.3-10.6ng/test)

Regione 13qter, 13q34 verde (24.7-36.9ng/test)

La sonda 13q14.3, marcata in rosso, copre i marcatori D13S319 e D13S25. La sonda

subtelomerica specifica per 13qter (clone 163C9), marcata in verde, consente l'identificazione

del cromosoma 13 e agisce come sonda di controllo.

Materiali forniti

Ogni kit contiene i seguenti reagenti, sufficienti per 2 (PMP 018), 5 (PMP 017) o 10 (PMP 016)

campioni del paziente:

1. 2, 5 o 10 dispositivi Chromoprobe Multiprobe®-CLL rivestito con sonde marcate

direttamente.

2. 4, 7 o 12 vetrini con impresso uno stampo specifico

3. 500µl di soluzione di ibridizzazione (formamide, destrano solfato, SSC)

4. 1 termometro di superficie per vetrini Cytocell

5. 1 camera di ibridizzazione Chromoprobe Multiprobe®Cytocell

Il kit per 20 test (PMP 020) è fornito come dispositivo Chromoprobe Multiprobe®4x5.

Avvertenze e misure precauzionali

1. Per uso diagnostico in vitro. Solo per uso professionale.

2. Indossare i guanti durante la manipolazione della soluzione di ibridazione, delle sonde di

DNA e della colorazione di contrasto DAPI.

3. La soluzione di ibridazione contiene formammide, che è un teratogeno; non inalare i fumi

ed evitare il contatto con la pelle. Indossare guanti, camice da laboratorio e manipolare in

una cappa aspirante. Per lo smaltimento, sciacquare abbondantemente con acqua.

4. DAPI è un potenziale cancerogeno. Maneggiare con cura; indossare guanti e camice da

laboratorio. Per lo smaltimento, sciacquare abbondantemente con acqua.

5. Lo smaltimento dei materiali pericolosi deve avvenire nel rispetto delle normative interne

relative allo smaltimento dei rifiuti pericolosi.

6. Gli operatori devono essere in grado di distinguere visivamente tra rosso, blu e verde.

7. Il mancato rispetto del protocollo può influire sulle prestazioni e generare risultati

falsi positivi o falsi negativi.

Conservazione e utilizzo

Il kit Chromoprobe Multiprobe®deve essere conservato a 2-8ºC fino alla data di scadenza

indicata sull’etichetta. Non congelare.

Attrezzature e materiali richiesti ma non in dotazione

1. 500µl di controcolorante (antifade DAPI (ES: 0,125µg/ml di DAPI (4,6-diamidino-2-

fenilindolo))).

2. Piastra riscaldante (con - un controllo accurato della temperatura fino ad 80ºC).

3. Micropipette a volume variabile compreso tra 1µl - 200µl.

4. Bagno termostatato con controllo accurato della temperatura a 72ºC.

5. Provette da microcentrifuga (0,5 ml).

6. Microscopio a fluorescenza (riferirsi alla sezione Configurazione ottimale del microscopio

e dei filtri).

7. Contenitori di Coplin in plastica o vetro.

8. Pinzette.

9. Olio per lenti ad immersione del microscopio a fluorescenza.

10. Centrifuga da banco.

11. Vetrini coprioggetto per microscopio a fluorescenza (24 x 50mm).

12. Timer.

13. Bagnomaria a 37ºC senza agitatore.

Configurazione ottimale del microscopio e dei filtri

Per una visualizzazione ottimale, utilizzare una lampada al mercurio da 100-W e obiettivi

apocromatici piani di tipo x63 o x100. Per una visualizzazione ottimale e simultanea dei fluorofori

rossi e verdi e DAPI, utilizzare un filtro passa banda triplo DAPI/FITC/Texas Red.

Prima dell’uso, verificare il corretto funzionamento del microscopio a fluorescenza. Utilizzare olio

da immersione adatto per microscopia a fluorescenza e formulato per bassa auto-fluorescenza.

Evitare di mischiare la soluzione DAPI Antifade con l’olio da immersione per microscopio poiché

questo oscura i segnali. Seguire le raccomandazioni dei produttori relative alla durata della

lampada e all’età dei filtri.

Preparazione del campione

La Chromoprobe Multiprobe®è concepita per essere utilizzata su cellule del sangue periferico

coltivate o su cellule del midollo spinale coltivate fissate nel fissativo di Carnoy che deve essere

preparato secondo le linee guida del laboratorio o dell'istituzione.

Preparare i campioni asciugati all’aria sui vetrini a stampo del Chromoprobe Multiprobe®Cytocell

in conformità con il protocollo Cytocell riportato qui sotto. Si sconsiglia di essiccare a caldo o

processare altrimenti i vetrini in quanto si potrebbe ridurre la fluorescenza del segnale.

Protocollo Chromoprobe Multiprobe®

N.B.: le sonde utilizzate con il dispositivo Chromoprobe Multiprobe®sono marcate direttamente

con fluorofori, che sono sensibili alla luce. Verificare che in ogni fase venga limitata l’esposizione

delle sonde alle luci del laboratorio (non è necessario lavorare al buio).

1. Preparazione del vetrino

a) Pulire un vetrino a stampo. Immergerlo per 2 minuti in metanolo al 100% e asciugarlo

minuziosamente con un panno morbido pulito.

b) Determinare l’indice mitotico corretto. È importante che i campioni designati abbiano un

indice mitotico sufficientemente alto da consentire la rilevazione della anomalie

cromosomiche. Per verificare la densità del campione, pipettare con una micropipetta (es.

una Gilson P10 o P20) 4µl della sospensione cellulare su una delle aree del vetrino a

stampo vuoto e lasciare asciugare all'aria. Vista l’entità minima del volume utilizzato, di

solito per trasferire la sospensione sarà necessario toccare delicatamente il vetrino con la

punta della pipetta. Esaminare al microscopio a contrasto di fase. Se la densità cellulare è

troppo elevata, diluire la sospensione con dell’altro fissativo. Se l’indice mitotico è troppo

basso, centrifugare a bassa velocità la sospensione cellulare fissata a 160 g per 10 minuti.

PI025/CE v009.00/2019-04-30 (H001 v3 / H002 v2 / H023 v3 / H024 v3 / H026 v2 / H027 v3 / H037 v2 / H039 v6 / H072 v3)

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Osservare il volume del surnatante, rimuoverlo e risospendere il pellet cellulare in un

volume inferiore di fissativo. Se la densità del campione cellulare è stata modificata,

trasferire 4µl del campione concentrato in un altro riquadro del vetrino per il test e

riesaminarlo al microscopio a contrasto di fase.

N.B.: 50µl è il volume minimo necessario per il protocollo.

c) Controllo della qualità dei campioni. Si deve verificare l’eventuale presenza di citoplasma

nei campioni, che interferirebbe con il protocollo in situ. Se all’osservazione al microscopio

a contrasto di fase i cromosomi appaiono circondati da materiale granulare, i risultati del

test saranno compromessi. Un metodo per ridurre la presenza di citoplasma è trasferire 4µl

del campione sul vetrino a stampo e osservare la propagazione del fissativo. In condizioni

normali, il fissativo raggiunge un’espansione massima, si ritira e quindi evapora. Per ripulire

efficacemente il campione da eventuali tracce di citoplasma, un sistema efficace consiste

nel lasciare cadere una goccia di fissativo sul campione nel momento in cui il fissativo in

espansione ha raggiunto il suo massimo. Lasciare evaporare la goccia di fissativo e

riesaminare il campione.

d) Trasferimento sul vetrino. Pipettare 4µl di sospensione cellulare su tuttele 8 aree del vetrino

a stampo procedendo su riquadri alternati come indicato qui sotto. Così facendo si eviterà

che l’espansione delle cellule provochi interferenze reciproche.

e) Una volta che la prima serie di gocce si è asciugata all’aria, trasferire gocce da 4µl nei

riquadri ancora vuoti, con la stessa modalità. Dopo che il vetrino si è asciugato,

osservandolo al microscopio a contrasto di fase si potrà verificare se tutti i riquadri sono

stati riempiti. Se così nonfosse, o se qualche riquadro contenesse un numero insufficiente

di cellule, basterà ripetere il trasferimento su questi riquadri: non è necessario ripetere il

trasferimento su un altro vetrino. Se esaminando il vetrino si notasse un riquadro con un

numero insufficiente di cellule o di metafasi, aggiungere una o più gocce di sospensione

per aumentare la densità cellulare.

N.B.: se le metafasi appaiono troppo diffuse, pulire accuratamente un nuovo vetrino a stampo

in metanolo ed effettuare un nuovo trasferimento facendo asciugare ogni goccia prima di

procedere con la successiva.

2. Preparazione del dispositivo Chromoprobe Multiprobe®e del vetrino a stampo

a) Accertarsi che la Camera di ibridizzazione Chromoprobe Multiprobe®sia nel bagnomaria a

37ºC e lasciare che si equilibri a 37ºC (+/- 1ºC). Seil bagnomaria è stato acceso con acqua

fredda potrebbe essere necessaria anche un'ora.

b) Miscelare la soluzione di ibridizzazione pipettando ripetutamente e preriscaldare a 37ºC

un'aliquota da 25µl per dispositivo. Pre-riscaldare inoltre ogni dispositivo ponendolo su una

piastra a 37ºC con l'etichetta rivolta verso il basso. Non toccare le superfici in rilievo del

dispositivo.

c) Immergere i vetrini a stampo contenenti i campioni fissati in 2xSSC per 2 minuti a

temperatura ambiente (TA) senza agitare.

d) Mentre il dispositivo è ancora a 37ºC, disidratare i vetrini a stampo contenenti i campioni

fissati con diluizioni di etanolo in serie (70%, 85% e 100%, 2 minuti ciascuno) a TA,

asciugare all’aria e riscaldare su una piastra a 37 ºC.

e) Aggiungere, con una micropipetta P10, 2µl di soluzione di ibridizzazione preriscaldata a

ognuna delle 8 aree presenti sul dispositivo preriscaldato, mentre è ancora sulla piastra a

37ºC.

3. Posizionamento del vetrino a stampo sul dispositivo

a) Capovolgere con cura il vetrino a stampo sul dispositivo in modo che il numero 1, che ora

è a testa in giù, si trovi sopra l'area in alto a destra del dispositivo (Figura 1).

Figura 1. Posizione delle sonde sul sistema Chromoprobe Multiprobe®CLL. Per facilitare la

localizzazione del riquadro numero 1, la sua posizione sul dispositivo è stata contrassegnata da

un’etichetta colorata.

b) Verificare il preciso allineamento del vetrino a stampo con le corrispondenti aree del

dispositivo. Abbassare con cura il vetrino sul dispositivo in modo che le gocce di soluzione

di ibridizzazione entrino in contatto con il vetrino. Applicare una pressione leggera ed

uniforme per fare sì che la soluzione di ibridizzazione diffonda fino ai margini di ciascuna

delle aree in rilievo del dispositivo.

c) Sollevare con cura il vetrino tenendolo per l'estremità smerigliata e capovolgerlo in modo

che il vetrino stesso si trovi al di sotto del dispositivo. Accertarsi che il dispositivo non strisci

lungo il vetrino a stampo, causando la contaminazione crociata delle sonde.

d) Porre su una piastra o un incubatore a 37ºC (+/- 1ºC) per 10 minuti.

4. Istruzioni per l’uso del termometro di superficie per vetrini Cytocell

a) Prima di procedere alla denaturazione, con il termometro di superficie per vetrini Cytocell

controllare che la temperatura della piastra sia di 75ºC.

b) Per utilizzare il termometro in modo appropriato, posizionarlo sulla superficie della piastra

e attendere che i diversi segmenti smettano di cambiare colore. La temperatura effettiva è

indicata da un colore turchese intenso.

N.B.:

c) Quando i segmenti hanno un aspetto granulare ed i colori non sono più uniformi e regolari,

il termometro deve essere eliminato perché esaurito. La durata di ogni termometro, tuttavia,

dovrebbe essere sufficiente per un kit da 10 dispositivi.

d) Il termometro è un dispositivo a cristalli liquidi e, benché riutilizzabile, deve essere trattato

con cura per garantire una durata adeguata. Il termometro deve essere utilizzato solo per

controllare la temperatura delle piastre, non per effettuare il monitoraggio delle loro

prestazioni nel tempo.

5. Denaturazione

N.B.: per questa procedura NON è possibile utilizzare un blocco riscaldante del

termociclatore per la PCR al posto di una piastra solida.

a) Trasferire sulla piastra l’insieme vetrino/dispositivo facendo molta attenzione a tenerlo in

posizione orizzontale. Verificare che il vetrino con i campioni sia bene a contatto con la

piastra.

b) Denaturare sulla piastra a 75ºC (+/- 1ºC) per 2 minuti.

6. Ibridizzazione

Porre l’insieme vetrino/dispositivo nella camera di ibridizzazione Chromoprobe Multiprobe®

preriscaldata, riposizionare il coperchio e far flottare la camera nel bagnomaria a 37ºC (+/-

1ºC) (senza agitazione) per tutta la notte.

N.B.:

a) Non sigillare il coperchio sulla camera di ibridizzazione.

b) Non chiudere il bagnomaria con un coperchio.

c) Non effettuare l’ibridizzazione in un incubatore.

d) Accertarsi che la camera di ibridizzazione sia completamente asciutta (cioè che

all'interno della camera non vi siano acqua o panni umidi).

Il livello di umidità all'interno della camera è essenziale per una ibridizzazione

ottimale. Per ottenere i livelli corretti procedere come indicato qui sotto.

7. Lavaggi stringenti post-ibridizzazione

N.B.: non sottoporre alla procedura dei lavaggi stringenti più di due vetrini per volta.

a) Rimuovere con cura il dispositivo dal vetrino.

b) Immergere il vetrino in 0,4xSCC (pH 7,0) a 72ºC (+/- 1ºC) per 2 minuti senza agitare.

c) Fare sgocciolare il vetrino e immergerlo in 2xSCC, 0,05% Tween-20 a TA (pH 7,0) per 30

secondi senza agitare.

8. Montaggio e visualizzazione dei risultati

a) Fare sgocciolare il vetrino e applicare a ogni estremità 20µl di antifade DAPI.

b) Coprire con un coprioggetto (24 x 50mm), rimuovere eventuali bolle e lasciare che il colore

si sviluppi al buio per 10 minuti.

c) Osservare con un microscopio a fluorescenza.

N.B.: alcuni microscopi hanno un supporto per vetrini che rende difficile visualizzare le estremità

del vetrino stesso. In questo caso è sufficiente ruotare il vetrino di 180per agevolarne la

visualizzazione.

Stabilità del vetrino finito

I vetrini FISH restano analizzabili per circa 1 mese se conservati al buio a temperatura ambiente

o inferiore.

Raccomandazioni per l'uso

1. La cottura o l’invecchiamento dei vetrini potrebbe ridurre la fluorescenza del segnale.

2. Le condizioni di ibridazione potrebbero essere influenzate negativamente dall’uso di

reagenti diversi da quelli forniti o raccomandati da Cytocell Ltd.

3. Usare un termometro calibrato per misurare la temperatura delle soluzioni, dell’acqua e

degli incubatori, poiché queste temperature sono fondamentali per ottimizzare le

prestazioni del prodotto.

4. Le concentrazioni, il pH e la temperatura del lavaggio sono importanti, in quanto una

stringenza bassa potrebbe causare un legame non specifico della sonda, mentre una

stringenza troppo elevata potrebbe causare un’assenza di segnale.

5. La denaturazione incompleta può causare un’assenza di segnale, mentre anche una

denaturazione eccessiva può causare un legame non specifico.

6. Un eccesso di ibridazione può causare segnali aggiuntivi o imprevisti.

7. Gli utenti sono tenuti a ottimizzare il protocollo a seconda dei loro campioni, prima di

utilizzare il test per finalità diagnostiche.

8. I vetrini devono essere valutati indipendentemente da due analisti.

9. In caso di legami non specifici potrebbero verificarsi delle condizioni non ottimali, che

potrebbero essere erroneamente interpretate come segnali della sonda.

Risultati attesi

MYB Deletion

In una cellula normale ci dovrebbero essere due segnali rossi e due verdi (2R, 2G) mentre una

cellula con una delezione di MYB dovrebbe avere un segnale rosso e due verdi (1R, 2G).

Chromosome 12 Enumeration

In una cellula normale si dovrebberoosservare due segnali rossi (2R).In una cellula con trisomia

12 ci dovrebbero essere tre segnali rossi (3R).

ATM Deletion

In una cellula normale ci dovrebbero essere due segnali rossi e due verdi (2R, 2G) mentre una

cellula con una delezione di ATM dovrebbe avere un segnale rosso e due verdi (1R, 2G).

IGH/BCL2 Translocation, Dual Fusion

In una cellula normale queste sonde dovrebbero apparire come spot discreti rossi e verdi, uno

per ogni omologo (il risultato è una conformazione 2R, 2G). In un paziente t(14;18)(q32.3;q21) ci

dovrebbero essere due segnali di fusione gialli oltre ai segnali rosso e verde dei cromosomi

normali 18 e 14 rispettivamente (1R, 1G, 2Y).

IGH Breakapart

In una cellula normale ci si aspetta due segnali rosso/verde (o giallo fuso) (2Y). In una cellula

con una traslocazione IGH monoallelica ci dovrebbero essere un segnale distinto rosso e uno

verde oltre a un segnale rosso/verde (o giallo fuso) del cromosoma normale 14 (1R, 1G, 1Y). Nel

caso di una traslocazione biallelica non sarà presente alcun segnale fuso; si dovrebbero vedere

due segnali distinti rossi e due verdi (2R, 2G).

P53 Deletion

In una cellula normale ci dovrebbero essere due segnali rossi e due verdi (2R, 2G) mentre una

cellula con una delezione di P53 dovrebbe avere un segnale rosso e due verdi (1R, 2G).

IGH/CCND1 Translocation, Dual Fusion

In una cellula normale queste sonde dovrebbero apparire come spot discreti rossi e verdi, uno

per ogni omologo (il risultato è una conformazione 2R, 2G). In un paziente t(11;14)(q13;q32.3) ci

dovrebbero essere due segnali di fusione gialli oltre ai segnali rosso e verde dei cromosomi

normali 11 e 14 rispettivamente (1R, 1G, 2Y).

13q14.3 Deletion

PI025/CE v009.00/2019-04-30 (H001 v3 / H002 v2 / H023 v3 / H024 v3 / H026 v2 / H027 v3 / H037 v2 / H039 v6 / H072 v3)

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In una cellula normale ci dovrebbero essere due segnali rossi e due verdi (2R, 2G). Una cellula

con una delezione emizigotica del 13q14.3 dovrebbe avere un segnale rosso e due verdi (1R,

2G) mentre una cellula con una delezione omozigotica dovrebbe avere zero segnali rossi e due

verdi (0R, 2G).

Limitazioni

La creazione dei report e l’interpretazione dei risultati FISH devono essere coerenti con gli

standard professionali procedurali e devono prendere in considerazione anche altri dati clinici e

diagnostici. Questo kit è pensato come aggiuntivo rispetto ad altri test diagnostici di laboratorio;

l’azione terapeutica non deve essere avviata sulla sola base dei risultati FISH.

Il mancato rispetto del protocollo può influire sulle prestazioni e generare risultati falsi positivi o

falsi negativi.

Questo kit non è stato convalidato per finalità diverse da quelle dichiarate nella sezione sull’uso

previsto.

Informazioni aggiuntive

Per informazioni aggiuntive sul prodotto contattare il Dipartimento di Assistenza Tecnica Cytocell.

T: +44 (0)1223 294048

E: [email protected]

W: www.cytocell.com

DEUTSCH

Einleitung

Die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, mit der DNA-Sequenzen auf

Metaphase-Chromosomen oder Interphase-Kernen in fixierten zytogenetischen Proben

nachgewiesen werden können. Dabei werden DNA-Sonden verwendet, die an ganze

Chromosomen oder einzelne, einmalige Sequenzen hybridisieren. Kürzliche Entwicklungen

haben gezeigt, dass diese nützliche Technik nun auch als essentielles diagnostisches

Werkzeug für pränatale, hämatologische und pathologische Chromosomenanalysen eingesetzt

werden kann. Nachdem die zu untersuchende DNA fixiert und denaturiert wurde, kann die

Fluoreszenz markierte, einzelsträngige Sonde daran binden. Nach der Hybridisierung werden

nicht gebundene sowie unspezifisch gebundene DNA-Sonden durch eine Reihe von

Waschvorgängen entfernt und die DNA zur Visualisierung gegengefärbt. Unter dem

Fluoreszenzmikroskop wird dann die hybridisierte Sonde am Zielmaterial erkennbar.

Sondeninformation

Das Chromoprobe Multiprobe®CLL wurde von Cytocell entwickelt, damit Sonden der Nachweis

von del (6q), Trisomie 12, del (13q), del (17p), del (11q) und Umlagerungen von IGH, die zu den

14+ Markern führen, möglich ist und diese gleichzeitig in einer einzigen FISH-Reaktion auf eine

Patientenprobe angewendet werden können. Die Sonden wurden entwickelt, um in nicht

teilenden Zellen eindeutige Ergebnisse zu zeigen und somit die mittels dieser Technik erhaltenen

Informationen zu maximieren. Das Gerät kann zur Erstdiagnose, zur Bestätigung von Befunden

der Routinezytogenetik und auch zur Überwachung des Patienten im Zeitverlauf eingesetzt

werden. Das Gerät weist auch einen Sondensatz für t(11;14) auf, um Patienten mit anormaler

CLL von Patienten mit Mantelzelllymphom unterscheiden zu können.

Sondenspezifikation

MYB 6q23.3 Region, rot (5.25-8.85ng/test)

D6Z1 6p11.1-q11.1 Region, grün (6.85-10.3ng/test)

Die MYB-Sonde ist 183kb, rot markiert, deckt das gesamte MYB-Gen und eine telomerisch

gelegene Region zumGen, 137kb jenseits des Markers AFMA074ZG9, ab. Die Sondenmischung

enthält außerdem eine Kontrollsonde für das 6 Zentromer (D6Z1), grün markiert.

Chromosome 12 Enumeration

D12Z3 12p11.1-q11.1, Region, rot (0.28-0.47ng/test)

Die Chromosom-12-Alpha-Satellitensonde ist eine Wiederholungssequenzsonde, rot markiert,

die die zentromerische Wiederholungssequenz D12Z3 erkennt.

ATM Deletion

ATM 11q22.3 Region, rot (5.25-8.85ng/test)

11q12.1 Region, grün (20.6-30.8ng/test)

Die ATM-Sonde ist 182kb, rot markiert, und deckt das Telomerende des NPAT-Gens und das

zentromerische Ende des ATM-Gens bis knapp jenseits des Markers D11S3347 ab. Die Sonde

Mix enthält auch 11q12.1-Kontroll sonde grün markiert und deckt eine 122kb Region,

einschließlich der SHGC-154780 Marker und einer 130kb Region, einschließlich der SHGC-

110550-Marker.

IGH/BCL2 Translocation, Dual Fusion

BCL2 18q21.33 Region, rot (5.60-9.44ng/test)

IGH 14q32.33 Region, grün (13.7-20.5ng/test)

Das IGH/BCL2-Produkt besteht aus Sonden, grün markiert, die die konstanten, J, D und

variablen Segmente des IGH-Gens abdecken und aus einer 585kb-Sonde, rot markiert, die die

BCL2- und KDSR-Gene abdeckt.

IGH Breakapart

IGHC 14q32.33 Region, rot (5.25-8.85ng/test)

IGHV 14q32.33 Region, grün (13.7-20.5ng/test)

Das IGH-Produkt besteht aus einer 176kb-Sonde, rot markiert, die die konstante Region des

Gens abdeckt und eine grüne Sonde, die eine 617kb-Region innerhalb des variablen Segments

des Gens abdeckt.

P53 Deletion

P53 17p13.1 Region, rot (4.20-7.08ng/test)

D17Z1 17p11.1-q11.1 Region, grün (13.7-20.5ng/test)

Die P53-Sonde ist 161kb, rot markiert, deckt das gesamte P53 (TP53)-Gen ab, erstreckt sich

66kb telomerisch zum Gen und deckt eine Region zentromerisch zum Gen bis kurz hinter den

Marker D17S655 ab. Die Sondenmischung enthält außerdem eine Kontrollsonde für das 17

Zentromer (D17Z1), grün markiert

IGH/CCND1 Translocation, Dual Fusion

CCND1 (BCL1) 11q13.3 Region, rot (5.60-9.44ng/test)

IGH 14q32.33 Region, grün (13.7-20.5ng/test)

Das IGH/CCND1-Produkt besteht aus Sonden, grün markiert, die die konstanten, J- und D-

Segmente und das variable Segment des IGH-Gens abdecken und aus einer CCND1-Sonde, rot

markiert. Die CCND1-Sondenmischung enthält eine Sonde 155kb zentromerisch zum CCND1-

Gen gelegen, die eine Region zwischen den Markern D11S2663 und D11S4095 abdeckt, und

eine zweite Sonde (162kb), die das Telomerende des CCND1-Gens und die Region bis zum

FGF3-Gen abdeckt.

13q14.3 Deletion

13q14.2-q14.3 Region, rot (6.3-10.6ng/test)

13qter 13q34 Region, grün (24.7-36.9ng/test)

Die rot markierte 13q14.3-Sonde deckt die Marker D13S319 und D13S25 ab. Die grün markierte

13qter subtelomerspezifische Sonde (Klon 163C9) ermöglicht die Identifizierung von

Chromosom 13 und fungiert als Kontrollsonde.

Kitkomponenten

Jedes Kit enthält die folgenden Reagenzien, die für 2 (PMP 018), 5 (PMP 017) oder 10 (PMP

016) Patientenproben ausreichen:

1. 2, 5 oder 10 Chromoprobe Multiprobe®CLL Geräte, mit direkt markierten Sonden.

2. 4, 7 oder 12 Glasobjektträger, die mit einem speziellen Templat bedruckt sind

3. 500µl Hybridisierungsösung (Formamid, Dextransulfat, SSC)

4. 1 Cytocell Oberflächenthermometer für Objektträger

5. 1 Cytocell Chromoprobe Multiprobe®Hybridisierungskammer

Das Kit mit 20 Tests (PMP 020) wird als 4 x 5 Chromoprobe Multiprobe®Geräte geliefert.

Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen

1. Für In-vitro-Diagnostik. Nur zur professionellen Verwendung.

2. Beim Umgang mit der Hybridisierungslösung, DNA-Sonden und DAPI-Kontrastfärbung

sind Handschuhe zu tragen.

3. Die Hybridisierungslösung enthält Formamid, das zu den Teratogenen gehört; Dampf

nicht einatmen und Hautkontakt vermeiden. Tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel

und verwenden Sie die Lösung in der Nähe eines Laborabzugschrankes. Bei der

Entsorgung mit viel Wasser nachspülen.

4. DAPI ist ein potentielles Karzinogen. Es ist mit Vorsicht zu handhaben. Tragen Sie

Handschuhe und einen Laborkittel. Bei der Entsorgung mit viel Wasser nachspülen.

5. Alle gefährlichen Materialien sindin Übereinstimmung mit den Richtlinien Ihrer Einrichtung

zur Entsorgung von gefährlichen Abfällen zu entsorgen.

6. Anwender müssen optisch zwischen rot, grün und blau unterscheiden können.

7. Eine mangelnde Einhaltung des Protokolls kann die Leistung beeinträchtigen und zu

falsch positiven/negativen Ergebnissen führen.

Lagerung und Behandlung

Das Chromoprobe Multiprobe®Kit wird bis zum Ablauf des auf dem Kitetikett angegebenen

Haltbarkeitsdatums bei 2-8ºC gelagert. Nicht einfrieren.

Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Ausrüstung und Materialien

1. 500µl Gegenfärbung (DAPI Antifade (ES: 0,125µg/ml DAPI (4,6-Diamidino-2-phenyl-

indol))).

2. Heizplatte (mit stabiler Heizplatte und genauer Temperaturregelung bis 80ºC).

3. Mikropipetten mit variablem Volumen von 1 µl –200 µl.

4. Wasserbad mit genauer Temperaturkontrolle bei 72ºC.

5. Mikro-Zentrifugenröhrchen (0,5 ml).

6. Fluoreszenzmikroskop (siehe auch “Empfehlungen zum Fluoreszenzmikroskop”).

7. Coplin-Färbetrog aus Kunststoff oder Glas.

8. Pinzette.

9. Für Fluoreszenzobjektive geeignetes Immersionsöl.

10. Tischzentrifuge.

11. Fluoreszenztaugliche Glasdeckplättchen (24 x 50mm).

12. Timer.

13. Wasserbad mit 37ºC ohne Rührer.

Empfehlungen zum Fluoreszenzmikroskop

Verwenden Sie eine 100-Watt-Quecksilberdampflampe und die Objektive Plan-Apochromat x63

oder x100 für eine optimale Visualisierung. Verwenden Sie einen DAPI/FITC/Texas Red

Dreifach-Bandpassfilter für eine optimale gleichzeitige Visualisierung der grünen und roten

Fluorophore und DAPI.

Das Fluoreszenzmikroskop ist vor der Verwendung zu überprüfen, um sicherzustellen, dass es

korrekt funktioniert. Es ist ein Immersionsöl zu verwenden, das für Fluoreszenzmikroskopie

geeignet ist und für geringe Autofluoreszenz formuliert wurde. Eine Vermischung von DAPI

Antifade mit Mikroskop-Immersionsöl ist zu vermeiden, da dies die Signale verschleiern kann.

Die Herstellerempfehlungen bezüglich der Lebensdauer der Lampe und demAlter der Filter sind

zu befolgen.

Probenvorbereitung

Das Chromoprobe Multiprobe®wurde zur Verwendung mit kultivierten peripheren Blutzellen oder

kultivierten Knochenmarkzellen entwickelt, die in Carnoy-Fixiermittel fixiert sind, welches nach

Richtlinien des Labors oder Instituts herzustellen ist.

Präparieren Sie die luftgetrocknete Proben auf Cytocell Chromoprobe Multiprobe®Templat-

Objektträgern gemäß dem folgenden Cytocell Protokoll. Wärmebehandlung oder Reifung der

Objektträger ist nicht empfehlenswert, da dies zu einer verringerten Signalfluoreszenz führen

kann.

Chromoprobe Multiprobe®Protokoll

Bitte beachten: Die mit dem Chromoprobe Multiprobe®Gerät verwendeten Sonden sind direkt

mit Fluorophoren markiert und somit lichtempfindlich. Bitte stellen Sie sicher, dass die Sonde

nur in begrenztem Umfang der Strahlung von Laborlampen ausgesetzt ist (es ist nicht not-

wendig, im Dunklen zu arbeiten).

1. Vorbereitung des Objektträgers

a) Einen Templat-Objektträger reinigen. Den Templat-Objektträger 2 min lang in 100%

Methanol eintauchen und mit einem sauberen, weichen Tissuetuch trockenpolieren.

b) Korrekten Mitoseindex bestimmen. Der Nachweis von Chromosomenabnormalitäten ist

nur dann möglich, wenn die vorgesehene Probe einen ausreichend hohen Mitoseindex

aufweist. Zur Überprüfung der Dichte der Probe mithilfe einer Mikropipette (z. B. Gilson

P10 oder P20) 4µl der Zellsuspension auf einen der Bereiche des freien Templat-

Objektträgers pipettieren und an der Luft trocknen lassen. Das kleine Volumen bedeutet,

dass der Objektträger leicht mit der Pipettenspitze berührt werden sollte, um die

Suspension zu transferieren. Mittels Phasenkontrastmikroskopie untersuchen. Wenn die

Zelldichte zu hoch ist, die Suspension mit frischem Fixativ verdünnen. Wenn der

Mitoseindex zu niedrig ist, die fixierte Zellsuspension mit 160xg 10 min lang

zentrifugieren. Das Volumen des Überstands notieren, diesen abgießen und das

Zellpellet in einem kleineren Volumen an frischem Fixativ erneut suspendieren. Nach

Änderung der Zellprobendichte 4µl der konzentrierten Probe auf ein weiteres Quadrat

des Objektträgers tüpfeln und erneut durch Phasenkontrastmikroskopie untersuchen.

Bitte beachten: Für das Protokoll ist ein Mindestvolumen von 50µl erforderlich.

c) Qualitätskontrolle der Proben. Proben müssen auf Zytoplasma untersucht werden, da

dies das In-situ-Protokoll stört.Wenn die Chromosomen bei der Untersuchung mittels

Phasenkontrastmikroskopie von einem granulösen Material eingeschlossen zu sein

scheinen, können keine exakten Ergebnisse erzielt werden. Eine Methode zur

Reduktion des Zytoplasmas besteht darin, 4µl der Probe auf den Templat-

Objektträger zu tüpfeln und das Fixativ bei der Ausbreitung zu beobachten: Das

Fixativ breitet sich unter normalen Umständen maximal aus, weicht zurück und

verdampft dann. Wir haben festgestellt, dass die Aufreinigung von Zytoplasma dann

am erfolgreichsten ist, wenn in dem Augenblick, in dem das sich ausbreitende Fixativ

seine maximal Ausdehnung erreicht hat, ein frischer Tropfen Fixativ auf den Flecken

fallen gelassen wird. Den Tropfen Fixativ verdampfen lassen und den Flecken neu

untersuchen.

PI025/CE v009.00/2019-04-30 (H001 v3 / H002 v2 / H023 v3 / H024 v3 / H026 v2 / H027 v3 / H037 v2 / H039 v6 / H072 v3)

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d) Tüpfeln des Objektträgers. 4µl Zellsuspension in einer Sequenz von alternierenden

Quadraten wie anschließend gezeigt auf alle 8 Bereiche des Templat-Objektträgers

pipettieren. Dies verhindert, dass sich ausbreitende Proben gegenseitig stören.

e) Nachdem dem Trocknen der ersten Gruppe von Tropfen an Luft 4µl in derselben

Weise auf die restlichen Quadrate tüpfeln. Nach dem Trocknen des Objektträgers

zeigt die Untersuchung des Objektträgers unter Phasenkontrast, ob Quadrate

ausgelassen wurden. Wenn Quadrate nicht getüpfelt wurden oder zu wenig Zellen

aufweisen, diese Quadrate einfach erneut tüpfeln. Das Präparieren eines neuen

Objektträgers ist nicht erforderlich. Wenn ein Quadrat bei der Untersuchung des

Objektträgers zu wenige Zellen/Metaphasen aufweist, können 1 oder mehrere

Tropfen Suspension zugefügt werden, um die Zelldichte zu erhöhen.

Bitte beachten: Wenn die Metaphasen zu stark ausgebreitet erscheinen, wird ein neuer

Templat-Objektträger gründlich in Methanol gereinigt und erneut getüpfelt, wobei jeder

Fleck trocknen muss, ehe der nächste aufgetüpfelt wird.

2. Vorbereitung von Chromoprobe Multiprobe®Gerät und Templat-Objektträger

a) Kontrollieren, dass sich die Chromoprobe Multiprobe®Hybridisierungskammer im

37ºC warmenWasserbad befindet. Kammer auf 37ºC (+/- 1ºC) erwärmen lassen. Dies

kann bis zu einer Stunde dauern, wenn das Wasserbad kalt eingeschaltet wird.

b) Hybridisierungslösung durch wiederholtes Pipettieren mischen, und pro Gerät eine

25µl Aliquote auf 37ºC erwärmen. Auch jedes Gerät vorwärmen, indem es mit der

Etikettenseite nach unten auf eine 37ºC warme Heizplatte gelegt wird. Die erhabenen

Oberflächen des Geräts nicht berühren.

c) Templat-Objektträger, die fixierte Proben enthalten, 2 min bei Raumtemperatur (RT)

ohne Schütteln in 2xSSC eintauchen.

d) Während das Gerät noch 37ºC warm ist, die Templat-Objektträger, welche fixierte

Proben enthalten, mithilfe einer Ethanolreihe (jeweils 2 min in 70%, 85% und 100%)

bei RT entwässern, an der Luft trocknen lassen und zum Aufwärmen auf eine 37ºC

warme Heizplatte legen.

e) 2µl vorgewärmte Hybridisierungslösung mithilfe einer P10 Mikropipette auf jeden der

8 Bereiche des vorgewärmten Geräts geben, während es auf der 37ºC warmen

Heizplatte bleibt,

3. Positionierung des Templat-Objektträgers über dem Gerät

a) Templat-Objektträger über dem Gerät vorsichtig umdrehen, so dass sich die Nummer

1, die nun nach unten weist, über dem oberen rechten Bereich des Geräts befindet

(Abbildung 1).

Abbildung 1. Position der Sonden im Chromoprobe Multiprobe®CLL System. Um Quadrat

1 leichter finden zu können, ist dessen Position auf dem Gerät mit einem farbigen Etikett

markiert.

b) Kontrollieren, dass der Templat-Objektträger sorgfältig an den entsprechenden

Bereichen des Geräts ausgerichtet ist. Objektträger vorsichtig über dem Gerät

absenken, damit die Tropfen der Hybridisierungslösung Kontakt mit dem Objektträger

erhalten. Sanften gleichmäßigen Druck ausüben, damit sichergestellt ist, dass sich die

Hybridisierungslösung zu den Rändern jedes der erhabenen Bereiche auf dem Gerät

ausbreitet.

c) Objektträger vorsichtig anheben, dazu das gefrostete Ende des Glasobjektträgers

halten und den Träger umdrehen, so dass sich der Templat-Objektträger unter dem

Gerät befindet. Kontrollieren, dass der Templat-Objektträger nicht durch das Gerät

verschmiert wird, da dies zu Kreuzverunreinigung der Sonden führen kann.

d) 10 min lang bei 37ºC (+/- 1ºC) (Heizplatte oder Inkubator) stehen lassen.

4. Anweisungen zur Verwendung des Cytocell Oberflächenthermometers für

Objektträger

a) Vor Beginn der Denaturierung mithilfe des Cytocell Oberflächenthermometers für

Objektträger überprüfen, ob die Heizplatte 75ºC warm ist.

b) Korrekte Anwendung des Thermometers: Thermometer auf die Oberfläche der Heiz-

platte legen und warten, bis die verschiedenen Segmente ihre Farbe nicht mehr

ändern. Die tatsächliche Temperatur wird durch eine tiefblaue Farbe angezeigt.

Bitte beachten:

c) Wenn die Segmente körnig aussehen und die Farben nicht länger einheitlich und

regelmäßig erscheinen, ist das Thermometer verbraucht und muss entsorgt werden.

Die Lebensdauer jedes Thermometers sollte jedoch für ein Kit mit 10 Geräten ohne

Weiteres ausreichen.

d) Das Thermometer ist ein Flüssigkristallgerät. Obgleich es wiederverwendbar ist, muss

es achtsam behandelt werden, um eine angemessene Lebensdauer sicherzustellen.

Das Thermometer darf nur zur Prüfung der Temperatur einer Heizplatte verwendet

werden. Es darf nicht eingesetzt werden, um die Leistung der Heizplatte über eine

längere Zeit zu überwachen.

5. Denaturierung

Bitte beachten: Für dieses Verfahren darf die Festbett-Heizplatte NICHT durch den

Heizblock eines PCR–Thermocyclers ersetzt werden.

a) Die sandwichförmige Objektträger/Gerät-Anordnung auf die Heizplatte transferieren,

wobei besonders darauf geachtet werden muss, sie waagerecht zu halten.

Kontrollieren, dass der Probenobjektträger ausreichend Kontakt mit der Heizplatte

hat.

b) Auf der Heizplatte bei 75ºC (+/- 1ºC) 2 min lang denaturieren.

6. Hybridisierung

Die sandwichförmige Objektträger/Gerät-Anordnung in die vorgewärmte Chromo-

probe Multiprobe®Hybridisierungskammer legen, den Deckel wieder auflegen und die

Kammer im 37ºC (+/- 1ºC) warmen Wasserbad mit (ohne Rühren) über Nacht

schweben lassen.

Bitte beachten:

a) Deckel auf der Hybridisierungskammer nicht versiegeln.

b) Keinen Deckel auf das Wasserbad legen.

c) Nicht in einem Inkubator hybridisieren.

d) Bitte sicherstellen, dass die Hybridisierungskammer vollständig trocken ist (d. h.

weder Wasser noch feuchtes Gewebe im Inneren der Kammer ist).

Die Feuchtigkeit in der Kammer ist für die optimale Hybridisierung sehr wichtig.

Das korrekte Niveau mithilfe der obigen Schritte aufrechterhalten.

7. Stringente Wäschen nach der Hybridisierung

Bitte beachten: Nicht mehr als zwei Objektträger gleichzeitig während der stringenten

Wäschen verarbeiten.

a) Gerät vorsichtig von dem Objektträger entfernen.

b) Objektträger 2 min lang ohne Rühren in 0,4xSSC (pH 7,0) eintauchen.

c) Objektträger abtropfen lassen und 30 Sekunden lang ohne Durchmischen in 2xSSC,

0,05% Tween-20 bei RT (pH 7,0) eintauchen.

8. Aufziehen und Visualisierung der Ergebnisse

a) Objektträger abtropfen lassen und an jedem Ende des Objektträgers 20µl DAPI

Antifade aufbringen.

b) Mit einem Deckglas (24 x 50mm) abdecken, die Luftblasen entfernen und die Farbe

10 min lang im Dunkeln entwickeln lassen.

c) Unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachten.

Bitte beachten: Einige Mikroskoptypen haben Objektträgerhalter, die es erschweren, die

äußersten Enden des Objektträgers zu betrachten. Falls dies vorkommt, einfach den

Objektträger um 180° drehen, um seine Betrachtung zu erleichtern.

Stabilität der fertigen Objektträger

Objektträger mit FISH-Proben können bis zu einem Monat lang analysiert werden, wenn sie im

Dunkeln bei oder unter Raumtemperatur gelagert werden.

Empfehlungen zur Durchführung

1. Das Backen oder Altern der Objektträger kann das Fluoreszenzsignal verringern.

2. Die Hybridisierungskonditionen können durch die Verwendung von anderen als den von

Cytocell Ltd. zur Verfügung gestellten oder empfohlenen Reagenzien nachteilig beeinflusst

werden.

3. Es wird dringend empfohlen, zur Temperaturmessung von Lösungen, Wasserbädern und

Inkubatoren ein geeichtes Thermometer zu verwenden, da diese Temperaturen für die

optimale Leistung des Produkts ausschlaggebend sind.

4. Die Konzentration der Waschlösung, pH-Wert und Temperaturen sind besonders wichtig,

da eine niedrige Stringenz zu einer unspezifischen Bindung der Probe und eine zu hohe

Stringenz zu einem fehlenden Signal führen kann.

5. Eine unvollständige Denaturierung kann zu einem fehlenden Signal und eine

Überdenaturierung ebenfalls zu einer unspezifischen Bindung führen.

6. Eine Überhybridisierung kann zu zusätzlichen oder unerwarteten Signalen führen.

7. Benutzer sollten das Protokoll für ihre eigenen Proben optimieren, bevor der Test für

diagnostische Zwecke verwendet wird.

8. Die Objektträger sind von zwei Analysten unabhängig voneinander zu bewerten.

9. Suboptimale Konditionen können zu einer unspezifischen Bindung führen, die als

Probensignal fehlinterpretiert werden kann.

Zu erwartende Ergebnisse

MYB Deletion

In einer normalen Zelle sollten zwei rote und zwei grüne Signale vorhanden sein (2R, 2G),

während eine Zelle mit einer MYB-Deletion ein rotes und zwei grüne Signale (1R, 2G) aufweisen

sollte.

Chromosome 12 Enumeration

In einer normalen Zelle sollten zwei rote Signale zu beobachten sein (2R). In einer Zelle mit

Trisomie 12 sollten drei rote Signale vorhanden sein (3R).

ATM Deletion

In einer normalen Zelle sollten zwei rote und zwei grüne Signale vorhanden sein (2R, 2G),

während eine Zelle mit einer ATM-Deletion ein rotes und zwei grüne Signale (1R, 2G) aufweisen

sollte.

IGH/BCL2 Translocation, Dual Fusion

In einer normalen Zelle sollten diese Sonden als diskrete rote und grüne Flecken erscheinen,

einen für jedes Homolog (was zu einer 2R, 2GKonformation führt). Beieinem t(14;18)(q32.3;q21)

Patienten sollten zwei gelbe Fusionssignale zusätzlich zu den roten und grünen Signalen der

normalen Chromosome 18 und 14 vorhanden sein (1R, 1G, 2Y).

IGH Breakapart

In einer normalen Zelle sind zwei rot/grüne (oder fusionierte gelbe) Signale zu erwarten (2Y). In

einer Zelle mit monoallelischer IGH-Translokation sollte ein deutliches rotes und ein grünes

Signal, zusätzlich zu einem rot/grünen (oder fusioniertem gelben) Signal des normalen

Chromosoms 14 vorhanden sein (1R, 1G, 1Y). Im Falle einer biallelischen Translokation wären

keine fusionierten Signale vorhanden; es sollten zwei verschiedene rote und zwei grüne Signale

zu beobachten sein (2R, 2G).

P53 Deletion

In einer normalen Zelle sollten zwei rote und zwei grüne Signale vorhanden sein (2R, 2G),

während eine Zelle mit einer P53-Deletion ein rotes und zwei grüne Signale (1R, 2G) aufweisen

sollte.

IGH/CCND1 Translocation, Dual Fusion

In einer normalen Zelle sollten diese Sonden als diskrete rote und grüne Flecken erscheinen,

einen für jedes Homolog (was zu einer 2R, 2GKonformation führt). Bei einem t(11;14)(q13;q32.3)

PI025/CE v009.00/2019-04-30 (H001 v3 / H002 v2 / H023 v3 / H024 v3 / H026 v2 / H027 v3 / H037 v2 / H039 v6 / H072 v3)

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Patienten sollten zwei gelbe Fusionssignale zusätzlich zu den roten und grünen Signalen der

normalen Chromosome 11 und 14 vorhanden sein (1R, 1G, 2Y).

13q14.3 Deletion

In einer normalen Zelle sollten zwei rote und zwei grüne Signale vorhanden sein (2R, 2G). Eine

Zelle mit einer hemizygoten Deletion von 13q14.3 sollte ein rotes und zwei grüne Signale (1R,

2G) aufweisen, während eine Zelle mit einer homozygoten Deletion kein rotes und zwei grüne

Signale aufweisen sollte (0R, 2G).

Einschränkungen

Die Angabe und Auswertung der FISH-Ergebnisse muss konsistent anhand von

professionellen Laborstandards erfolgen und muss andere klinische und diagnostische

Informationen berücksichtigen. Dieses Set ist als Ergänzung zu anderen diagnostischen

Labortests zu verstehen und therapeutische Maßnahmen sollten nicht allein auf Grundlage der

FISH-Ergebnisse eingeleitet werden.

Eine mangelnde Einhaltung des Protokolls kann die Leistung beeinträchtigen und zu falsch

positiven/negativen Ergebnissen führen.

Dieses Set wurde nicht für andere Zwecke als dem angegebenen Verwendungszweck geprüft.

Weitere Informationen:

Weitere Produktinformationen erhalten Sie vom Technischen Kundendienst von Cytocell.

T: +44 (0)1223 294048

E: [email protected]

W: www.cytocell.com

ESPAÑOL

Introducción

La hibridación in situ fluorescente (FISH) es una técnica que permite detectar secuencias de

ADN en cromosomas metafásicos o núcleos interfásicos en muestras citogenéticas y fijadas.

En la técnica se utiliza una sonda de ADN que hibrida los cromosomas completos o las

secuencias únicas simples y es un complemento útil para la citogenética clásica. Recientes

estudios indican que esta es una técnica que puede aplicarse como herramienta esencial de

diagnóstico prenatal, hematológico y patológico. Después de la fijación, el ADN diana se trata

con calor para desnaturalizar el ADN bicatenario haciendo que resulte monocatenario. El ADN

diana queda entonces disponible para hibridarlo con una sonda de ADN igualmente

desnaturalizado, monocatenario marcado con fluorescencia que tiene una secuencia

complementaria. Después de la hibridación la sonda de ADN no específicamente hibridada y

no hibridada se elimina y se aplica un contraste al ADN para su visualización. El uso de un

microscopio de fluorescencia permite la visualización de la sonda hibridada en el material

utilizado.

Información sobre las sondas

El desarrollo de Chromoprobe Multiprobe®de Cytocell para CLL permite a las sondas detectar

del (6q), trisomía 12, del (13q), del (17p), del (11q) y reorganizaciones de la IGH, que conducen

a los marcadores 14+, que pueden aplicarse simultáneamente en una muestra de un paciente

en una única reacción FISH. El desarrollo de las sondas tiene como objetivo ofrecer resultados

claros en las células que no están en división y, por tanto, maximizar la información obtenida

con la técnica. El dispositivo se puede usar para diagnóstico inicial, para confirmar los hallazgos

de citogenética de rutina y también para monitorizar al paciente a lo largo del tiempo. El

dispositivo también dispone de un juego de sondas para t(11;14) que permiten distinguir a los

pacientes con CLL anormal de los pacientes con linfoma de las células del manto.

Especificaciones de la sonda

Región MYB 6q23.3 en rojo (5.25-8.85ng/análisis)

Región D6Z1 6p11.1-q11.1 en verde (6.85-10.3ng/análisis)

La sonda MYB es de 183kb, marcada en rojo, cubre todo el gen MYB completo y una región

telomérica al gen, 137kb más allá del marcador AFMA074ZG9. La combinación de sondas

también contiene una sonda de control para el centrómero 6 (D6Z1) marcada en verde.

Chromosome 12 Enumeration

Región D12Z3 12p11.1-q11.1 en rojo (0.28-0.47ng/análisis)

La sonda alfa satélite del cromosoma 12 es una sonda de secuencia repetitiva, marcada en rojo,

que reconoce la secuencia repetitiva centromérica de D12Z3.

ATM Deletion

Región ATM 11q22.3 en rojo (5.25-8.85ng/análisis)

Región 11q12.1 en verde (20.6-30.8ng/análisis)

La sonda ATM es de 182kb, marcada en rojo, y cubre el extremo telomérico del gen NPAT y el

extremo centromérico del gen ATM hasta justo después del marcador D11S3347. La mezcla de

sondas contiene tan 11q12.1 sonda de control con la etiqueta de color verde, que cubre una

región 122kb incluyendo el marcador SHGC-154780 y una región de 130kb incluyendo el

marcador SHGC-110550.

IGH/BCL2 Translocation, Dual Fusion

Región BCL2 18q21.33 en rojo (5.60-9.44ng/análisis)

Región IGH 14q32.33 en verde (13.7-20.5ng/análisis)

El producto IGH/BCL2 se compone de sondas, marcadas enverde, que cubrenla los segmentos

constante, J, D y variable del gen IGH, y una sonda de 585kb, marcada en rojo, que cubre los

genes BCL2 y KDSR.

IGH Breakapart

Región IGHC 14q32.33 en rojo (5.25-8.85ng/análisis)

Región IGHV 14q32.33 en verde (13.7-20.5ng/análisis)

El producto IGH se compone de una sonda de 176kb, marcada en rojo, que cubre la región

constante del gen y una sonda verde, que cubre una región de 617kb dentro del segmento

variable del gen.

P53 Deletion

Región P53 17p13.1 en rojo (4.20-7.08ng/análisis)

Región D17Z1 17p11.1-q11.1 en verde (13.7-20.5ng/análisis)

La sonda P53 es de 161kb, marcada en rojo, cubre el gen P53 (TP53) completo, se extiende

66kb telomérica al gen y cubre una región centromérica al gen, hasta justo después del marcador

D17S655. La combinación de sondas también contiene una sonda de control para el centrómero

17 (D17Z1) marcada en verde.

IGH/CCND1 Translocation, Dual Fusion

Región CCND1 (BCL1) 11q13.3 en rojo (5.60-9.44ng/test)

Región IGH 14q32.33 en verde (13.7-20.5ng/análisis)

El producto IGH/CCND1 se compone de sondas, marcadas en verde, que cubren la región los

segmentos constante, J, D y variable del gen IGH, y sondas CCND1, marcadas en rojo. La

combinación de sondas CCND1 contiene una sonda de 155kb centromérica al gen CCND1, que

cubre una región entre los marcadores D11S2663 y D11S4095, y una segunda sonda (162kb)

que cubre el extremo telomérico del gen CCND1 y la región hasta el gen FGF3.

13q14.3 Deletion

Región 13q14.2-q14.3 en rojo (6.3-10.6ng/análisis)

Región 13qter 13q34 en verde (24.7-36.9ng/análisis)

La sonda 13q14.3, marcada en rojo, abarca los marcadores D13S319 y D13S25. La sonda

específica subtelomérica 13qter (clon 163C9), marcada en verde, permite la identificación del

cromosoma 13 y actúa como sonda de control.

Material incluido

Cada kit contiene los siguientes reactivos, suficiente para 2 (PMP 018), 5 (PMP 017) o 10 (PMP

016) muestras de pacientes:

1. 2, 5 o 10 aparatos Chromoprobe Multiprobe®CLL recubiertos con sondas marcadas

directamente.

2. 4, 7 o 12 portas de vidrio impresos con una rejilla especial

3. 500µl de solución de hibridación (formamida, sulfato de dextrano, SSC)

4. 1 termómetro para la superficie de los portas Cytocell

5. 1 cámara de hibridación del Chromoprobe Multiprobe®de Cytocell

El kit para 20 ensayos (PMP 020) se suministra como 4x5 dispositivos Chromoprobe

Multiprobe®.

Advertencias y precauciones

1. Para diagnóstico in vitro. Solo para uso profesional.

2. Utilice guantes para al manipular la solución de hibridación, las sondas de ADN y la

contratinción DAPI.

3. La solución de hibridación contiene formamida, que es un teratógeno; no inhale el vapor ni

permita que entre en contacto con la piel. Utilice guantes, bata de laboratorio y manipule

en una campana extractora de humos. Para eliminarla, aclare con abundante agua.

4. La contratinción DAPI puede producir cáncer. Manipúlela con cuidado; utilice guantes y

bata de laboratorio. Para eliminarla, aclare con abundante agua.

5. Deseche todos los materiales peligrosos conforme a las directrices de su institución

respecto a la eliminación de residuos peligrosos.

6. Los operadores deben ser capaces de diferenciar visualmente los colores rojo, azul y

verde.

7. No seguir el protocolo puede influir en el rendimiento y causar resultados falsos

positivos/negativos.

Almacenamiento y manejo

El kit Chromoprobe Multiprobe®debe almacenarse a 2-8ºC hasta la fecha de caducidad que se

indica en el envase. No congelar.

Equipos y material necesario pero no incluido

1. 500µl de contratinción (DAPI antifade (ES: 0,125µg/ml de DAPI (4,6-diamidino-2-

fenilindol))).

2. Placa caliente (con una placa sólida y un control de temperatura preciso hasta 80ºC).

3. Micropipetas de volumen variable (rango 1µl - 200µl).

4. Baño de agua con control preciso de temperatura a 72ºC.

5. Tubos de microcentrifugado (0.5ml).

6. Microscopio de fluorescencia (lea la sección Recomendaciones para el microscopio de

fluorescencia).

7. Recipientes de cristal y de plástico.

8. Pinzas.

9. Microscopio de fluorescencia con objetivo de inmersión en aceite.

10. Centrífuga de banco.

11. Cubre de cristal para fluorescencia (24 x 50mm).

12. Cronómetro.

13. Baño maría a 37ºC sin agitador.

Recomendaciones para el microscopio de fluorescencia

Utilice una lámpara de mercurio de 100 Watt y objetivos apocromáticos planos x63 o x100 para

una visualización óptima. Utilice un filtro triple paso banda DAPI/FITC/Texas Red para visualizar

los fluoróforos rojos y verdes y DAPI de manera óptima.

Compruebe el microscopio de fluorescencia antes de usarlo para asegurarse de que funciona

correctamente. Utilice un aceite de inmersión que sea adecuado para el microscopio de

fluorescencia y esté formulado para una baja autofluorescencia. Evite mezclar DAPI Antifade

con aceite de inmersión para microscopio, ya que esto impediría una visualización precisa de

los resultados. Siga las recomendaciones de los fabricantes respecto a la vida útil de la lámpara

y la edad de los filtros.

Preparación de la muestra

Chromoprobe Multiprobe®está diseñado para su uso en células sanguíneas periféricas

cultivadas o en células de médula ósea cultivadas y fijadas en fijador de Carnoy, y deben

prepararse de acuerdo con las instrucciones del laboratorio o la institución.

Prepare las muestras secadas al aire en los portas con rejilla Chromoprobe Multiprobe®de

Cytocell según el protocolo de Cytocell que se incluye a continuación. No se recomienda calentar

ni madurar los portas de otro modo ya que puede reducir la fluorescencia de la señal.

Protocolo para Chromoprobe Multiprobe®

Observación: Las sondas que se emplean en el aparato Chromoprobe Multiprobe®están

marcadas directamente con fluorocromos sensibles a la luz. Asegúrese de que las sondas están

expuestas a las luces del laboratorio durante el mínimo tiempo posible (no es necesario trabajar

sin luz).

1. Preparación de los portas

a. Limpieza de un porta con rejilla. Sumerja el porta con rejilla durante 2 minutos en metanol

100% y seque y abrillante con un paño suave.

b. Determinación del índice mitótico correcto. Es importante que la muestra que vaya a

emplear tenga un índice mitótico lo suficientemente alto para poder detectar anomalías en

los cromosomas. Para comprobar la densidad de la muestra, pipetee 4µl de la suspensión

celular con ayuda de una micropipeta (por ejemplo una Gilson P10 o P20) en una de las

áreas libres del porta con rejilla y déjelos secar al aire. Como el volumen que se usa es

muy pequeño, normalmente debe tocar suavemente el porta con la punta dela pipeta para

a transferir la suspensión. Examine el porta al microscopio de contraste de fases. Si la

densidad celular es demasiado alta, diluya la suspensión con fijador preparado reciente. Si

el índice mitótico es demasiado bajo, centrifugue la suspensión celular a 160 x g durante

10 minutos. Anote el volumen del sobrenadante, descártelo y resuspenda el sedimento de

células en un volumen menor de fijador reciente. Si se ha alterado la densidad de la

muestra de células, siembre 4µl dela muestra concentrada sobre otra casilla de prueba del

porta y vuelva a examinar al microscopio de contraste de fases.

Observación: El volumen mínimo necesario para el protocolo es de 50µl.

c. Control de calidad de las muestras. Las muestras deben examinarse para determinar la

presencia de citoplasma, ya que este interfiere con el protocolo in situ. Si los cromosomas

parecen estar incluidos en un material granuloso cuando se examinan al microscopio de

contraste de fases,los resultados severán afectados. Un método para reducir el citoplasma

es sembrar 4µl de la muestra sobre el porta con rejilla y observar cómo se extiende el

fijador: en situación normal, el fijador se extenderá al máximo, retrocederá y después se

evaporará. Para limpiar el citoplasma, se ha comprobado que se consiguen buenos

resultados si se deja caer una gota de fijador reciente sobre el punto en que se ha realizado

la siembra cuando la extensión del fijador haya alcanzado el máximo. Deje evaporar el

fijador y vuelva a examinar la siembra.

PI025/CE v009.00/2019-04-30 (H001 v3 / H002 v2 / H023 v3 / H024 v3 / H026 v2 / H027 v3 / H037 v2 / H039 v6 / H072 v3)

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d. Siembra del porta. Pipetee 4µl de suspensión celular en las 8 zonas del porta con rejilla

según la secuencia de casillas alternas que se muestra a continuación. Esto evitará que

las siembras de células interfieran entre sí.

e. Una vez que se ha secado al aire el primer grupo de gotas, siembre las casillas restantes

con gotas de 4µl del mismo modo. Cuando se haya secado el porta, examínelo al

microscopio de contraste de fases para comprobar que no falta ninguna de las casillas. Si

falta alguna, o si las casillas tienen pocas células, simplemente vuelva a sembrar esas

casillas: no es necesario utilizar un porta nuevo. Si al examinar el porta, una casilla tiene

un número insuficiente de células/metafases, pueden añadirse más gota(s) de la

suspensión para aumentar la densidad celular.

Observación: Si las metafases aparecen demasiado dispersas, limpie un nuevo porta con

rejilla cuidadosamente en metanol y vuelva a sembrar dejando que cada gota se seque antes

de pasar a la siguiente.

2. Preparación del aparato Chromoprobe Multiprobe®y del porta con rejilla

a) Asegúrese de que la cámara de hibridación del Chromoprobe Multiprobe®está al baño

maría a 37ºC y déjelo llegar al equilibrio a 37ºC (+/- 1ºC). Esto puede llevar hasta una hora

si el baño maría se enciende estando frío.

b) Mezcle la solución de hibridación pipeteando repetidamente y precaliente una alícuota de

25 µl por cada aparato a 37ºC. Precaliente también cada aparato colocándolo sobre una

placa calefactora a 37ºC con el lado de la etiqueta hacia abajo. No toque las superficies

elevadas del aparato.

c) Sumerja los portas con rejilla que contienen las muestras fijadas en 2xSSC durante 2

minutos a temperatura ambiente (TA) sin agitar.

d) Mientras el aparato está todavía a 37ºC, deshidrate los portas con rejilla que contienen las

muestras fijadas en una serie de etanol (2 minutos para cada una de las concentraciones:

70%, 85% y 100%) a TA, déjelos secar al aire y colóquelos sobre una placa calefactora a

37ºC para calentarlos.

e) Usando una micropipeta P10, añada 1 µl de solución de hibridación precalentada a cada

una de las 24 zonas del aparato precalentado sobre una placa calefactora a 37ºC.

3. Colocación del porta con rejilla sobre el aparato

a) Con cuidado invierta el porta con rejilla sobre el aparato de tal forma que el número 1, que

ahora está boca arriba, quede en la zona superior derecha del aparato (Figura 1).

Figura 1. Localización de las sondas en el Sistema Chromoprobe Multiprobe®CLL. Para facilitar

la localización de la casilla 1, su posición en el aparato se ha señalado con un marcador de color.

b) Asegúrese de que el porta con rejilla queda perfectamente alineado con las zonas

correspondientes del aparato. Con cuidado ponga el porta sobre el aparato de forma que

las gotas de la solución de hibridación entrenen contacto con el porta. Aplique una presión

suave y homogénea para asegurarse de que la solución de hibridación se extiende hasta

los bordes de cada una de las zonas elevadas del aparato.

c) Levante el porta con cuidado sujetándolo por el extremo esmerilado del porta de vidrio e

inviértalo de forma que el porta con rejilla quede por debajo del aparato. Asegúrese de que

el aparato no gotee sobre el porta con rejilla ya que esto podría provocar contaminación

cruzada de las sondas.

d) Póngalo a 37ºC (+/- 1ºC) (placa calefactora o incubadora) durante 10 minutos.

4. Instrucciones del termómetro de superficie para los portas Cytocell

a) Debe comprobarse que la temperatura de la placa calefactora está a 75ºC con el

termómetro de superficie para los portas Cytocell antes de realizar la desnaturalización.

b) Para usar el termómetro correctamente, colóquelo sobre la superficie de la placa

calefactora y espere hasta que los distintos segmentos dejen de cambiar de color. La

temperatura real se indica con un marcado color aqua.

Observación:

c) Si los segmentos tienen aspecto granuloso y los colores no son uniformes y regulares,

debe desecharse el termómetro ya que se ha gastado. La vida útil de cada termómetro

debería, fácilmente, ser suficiente para un kit de diez aparatos.

d) Este termómetro es un aparato de cristal líquido y, aunque reutlizable, debe tratarse con

cuidado para que la vida útil sea razonable. El termómetro únicamente debe emplearse

para controlar la temperatura de la placa calefactora; no debe usarse para controlar la

función de la placa calefactora durante todo el tiempo.

5. Desnaturalización

Observación: Para este procedimiento NO puede emplearse un bloque calefactor de

ciclado térmico para PCR en lugar de la placa calefactora de lecho sólido.

a) Transfiera el sándwich de porta y aparato a la placa calefactora poniendo especial atención

a que esté horizontal. Asegúrese de que el porta con las muestras hace buen contacto con

la placa calefactora.

b) Desnaturalice sobre la placa calefactora a 75ºC (+/- 1ºC) durante 2 minutos.

6. Hibridación

Introduzca el sándwich de porta y aparato en la cámara de hibridación precalentada del

Chromoprobe Multiprobe®, vuelva a poner la tapa y deje la cámara flotando al baño maría

a 37ºC (+/- 1ºC) (sin agitar) toda la noche.

Observación:

a) No selle la tapa de la cámara de hibridación.

b) No cubra el baño maría.

c) No realice la hibridación en una incubadora.

d) Asegúrese de que la cámara de hibridación está totalmente seca (es decir, que no queda

agua ni materiales húmedos en la cámara).

La humedad del interior de la cámara es vital para una hibridación óptima. Para

conseguir un nivel correcto, debe seguir estos pasos.

7. Lavados estringentes posthibridación

Observación: Evite realizar los lavados estringentes con más de dos portas a la vez.

a) Retire el aparato del porta con cuidado.

b) Sumerja el porta en 0,4xSSC (pH 7,0) a 72ºC (+/- 1ºC) durante 2 minutos sin agitar.

c) Escurra el porta y sumérjalo en 2xSSC, Tween-20 al 0,05% a TA (pH 7,0) durante 30

segundos sin agitar.

8. Montaje y visualización de los resultados

a) Escurra el porta y aplique 20µl de DAPI antifade en cada extremo del porta.

b) Tápelo con un cubre (24 x 50 mm), quite las burbujas y deje que el color aparezca durante

10 minutos.

c) Obsérvelo al microscopio de fluorescencia.

Observación: Algunos tipos de microscopio tienen pinzas de sujeción para los portas que

pueden dificultar la visualización de los extremos del porta. Si esto sucediera, simplemente gire

el porta 180, lo que ayudará a la observación del porta.

Estabilidad de los portaobjetos terminados

Los portaobjetos de FISH permanecen analizables durante 1 mes si se han almacenado en la

oscuridad y por debajo de la temperatura ambiente.

Recomendaciones de procedimiento

1. La cocción o el envejecimiento de las láminas puede reducir la fluorescencia de la señal

2. Las condiciones de hibridación pueden verse afectadas negativamente por el uso de

reactivos que no hayan sido suministrados o recomendados por Cytocell Ltd.

3. Use un termómetro calibrado para medir la temperatura de las soluciones, de los baños

maría y de las incubadoras, ya que estas temperaturas son cruciales para un rendimiento

óptimo del producto.

4. Las concentraciones de lavado, pH y temperaturas son importantes, dado que la baja

rigurosidad puede resultar en una fijación no específica de la sonda y una rigurosidad

demasiado alta puede dar lugar a una falta de señal.

5. Una desnaturalización incompleta puede dar lugar una falta de señal y una

sobredesnaturalización puede dar lugar a una fijación no específica.

6. La sobrehibridación puede dar lugar a señales inesperadas o adicionales.

7. Los usuarios deben optimizar los protocolos para sus propias muestras, antes de utilizar el

ensayo para fines de diagnóstico.

8. Las láminas deberán ser marcadas de manera independiente por dos analistas.

9. Las condiciones insuficientes pueden dar lugar a una fijación no específica, que podría

malinterpretarse como una señal de sonda.

Resultados esperados

MYB Deletion

En una célula normal deben existir dos señales rojas y dos vedes (2R, 2V) mientras que una

célula con una deleción MYB debe tener una señal roja y dos señales verdes (1R, 2V).

Chromosome 12 Enumeration

En una célula normal deben observarse dos señales rojas (2R). En una sonda con trisomía 12

deben existir tres señales rojas (3R).

ATM Deletion

En una célula normal deben existir dos señales rojas y dos vedes (2R, 2V) mientras que una

célula con una deleción ATM debe tener una señal roja y dos señales verdes (1R, 2V).

IGH/BCL2 Translocation, Dual Fusion

En una célula normal estas sondas deben aparecer como puntos verdes y rojos separados, uno

para cada homólogo (esto da lugar a una estructura 2R, 2V). En un paciente t(14;18)(q32.3;q21)

deben existir dos señales de fusión amarillas además de las señales roja y verde de los

cromosomas normales 18 y 14 respectivamente (1R, 1V, 2A).

IGH Breakapart

En una célula normal es de esperar que aparezcan dos señales rojas/verdes (o amarillas

fusionadas) (2A). En una célula con translocación IGH monoalélica deben existir una señal roja

y una verde separadas, además de una señal roja/verde (o amarilla fusionada) del cromosoma

normal 14 (1R, 1V, 1A). En el caso de una translocación bialélica, no debe existir ninguna señal

fusionada y deben observarse dos señales rojas y dos verdes (2R, 2V).

P53 Deletion

En una célula normal deben existir dos señales rojas y dos vedes (2R, 2V) mientras que una

célula con una deleción P53 debe tener una señal roja y dos señales verdes (1R, 2V).

IGH/CCND1 Translocation, Dual Fusion

En una célula normal estas sondas deben aparecer como puntos verdes y rojos separados, uno

para cada homólogo (esto da lugar a una estructura 2R, 2V). En un paciente t(11;14)(q13;q32.3)

deben existir dos señales de fusión amarillas además de las señales roja y verde de los

cromosomas normales 11 y 14 respectivamente (1R, 1V, 2A).

13q14.3 Deletion

En una célula normal deben existir dos señales rojas y dos verdes (2R, 2V). Una célula con una

deleción hemicigótica del 13q14.3 debe tener una señal roja y dos señales verdes (1R, 2V)

mientras que una célula con deleción homocigótica no tendrá ninguna señal roja y presentará

dos señales verdes (0R, 2V).

Limitaciones

Los informes y la interpretación de resultados FISH deberán ser consistentes con los

estándares profesionales de práctica y deberán tener en cuenta otra información de

diagnóstico y clínica. El kit está pensado como un adjunto a otros ensayos de laboratorio de

diagnóstico. No deben iniciarse acciones terapéuticas que se basen únicamente en el

resultado FISH.

No seguir el protocolo puede influir en el rendimiento y causar resultados falsos

positivos/negativos.

Este kit no se ha validado para fines diferentes al uso previsto declarado.

Información adicional

Si desea obtener información adicional sobre el producto, póngase en contacto con el

Departamento de soporte técnico de Cytocell.

T: +44 (0)1223 294048

PI025/CE v009.00/2019-04-30 (H001 v3 / H002 v2 / H023 v3 / H024 v3 / H026 v2 / H027 v3 / H037 v2 / H039 v6 / H072 v3)

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E: [email protected]

W: www.cytocell.com

REF

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DE: Bestellnummer

FR: Référence du catalogue

IT: Riferimento di Catalogo

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DE: In-vitro-Diagnostikum

FR: Dispositif médical de diagnostic in vitro

IT: Dispositivo medico-diagnostico in vitro

ES: Producto sanitario para diagnóstico in vitro

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DE: Loscode

FR: Code du lot

IT: Codice di lotto

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DE: Gebrauchsanweisung beachten

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IT: Consultare le istruzioni per l'uso

ES: Consúltense las instrucciones de uso

EN: Manufacturer

DE: Hersteller

FR: Fabricant

IT: Fabbricante

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DE: Verwendbar bis

FR: Utiliser jusqu’au

IT: Utilizzare entro

ES: Fecha de caducidad

EN: Temperature limitation

DE: Temperaturbegrenzung

FR: Limites de température

IT: Limiti di temperatura

ES: Limitación de temperatura

EN: Sufficient for <n> tests

DE: Ausreichend für

FR: Suffisant pour

IT: Sufficiente per

ES: Válido para

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DE: Inhalt

FR: Contenu

IT: Contenuto

ES: Contenido

Patents and Trademarks

Chromoprobe, Cytocell and Chromoprobe Multiprobe are registered trademarks of

Cytocell Ltd.

The Chromoprobe principle is covered by international patents WO9314223,

EP0623177. The design of the Multiprobe is a registered design and is also covered

by a Design Patent No. 420,745.

This product contains technology licensed from Life Technologies Corporation and

is available for human diagnostics or life science research use only.

Cytocell Ltd.

Oxford Gene Technology,

418 Cambridge Science Park,

Milton Road,

Cambridge, CB4 0PZ, UK

T: +44(0)1223 294048

F: +44(0)1223 294986

E: probes@cytocell.com

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