SYSMEX ogt Cytocell Multiprobe OctoChrome User manual

PI008/CE v011.00/2019-04-30
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Instructions For Use
REF: PMP 802 / PMP 804 / PMP 803
Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™
FOR PROFESSIONAL USE ONLY
ENGLISH/FRANÇAIS/ITALIANO/DEUTSCH/ESPAÑOL
Further information available at www.cytocell.com
Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) is a technique that allows DNA
sequences to be detected on metaphase chromosomes or in interphase nuclei
from fixed cytogenetic samples. The technique uses DNA probes that hybridise
to entire chromosomes or single unique sequences, and serves as a powerful
adjunct to classic cytogenetics. Recent developments have meant that this
valuable technique can now be applied as an essential diagnostic tool in prenatal,
haematological and pathological chromosomal analysis. Target DNA, after
fixation and denaturation, is available for annealing to a similarly denatured,
fluorescently labelled DNA probe, which has a complementary sequence.
Following hybridisation, unbound and non-specifically bound DNA probe is
removed and the DNA is counterstained for visualisation. Fluorescence
microscopy then allows the visualisation of the hybridised probe on the target
material.
Probe Information
Cytocell’s Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™combines the utility of an 8
square Multiprobe device and the whole chromosome painting probe (labelled in
3 different colours), to allow all 24 chromosomes to be identified on a single slide.
The OctoChrome™device allows the simultaneous analysis of the whole
genome on one slide in one hybridisation.
Probe Specification
Each square of the OctoChrome™device carries whole chromosome painting
probes for three different chromosomes in three different colour fluorophores,
red, green and blue (Texas Red, FITC and Aqua/DEAC spectra respectively)
which are visible simultaneously with a DAPI/FITC/Texas Red triple filter or
specific single filters.
The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome™device
has been designed to facilitate the identification of the non-random chromosome
rearrangements found in the most common leukaemias (Figure 1).
The OctoChrome™ is intended for FISH on metaphase chromosomes from fixed
cultured peripheral blood cells.
Figure 1. Location of the probes on the Chromoprobe Multiprobe®
OctoChrome™.
Materials Provided
Each kit contains the following reagents, which are sufficient for either 2 (PMP
802), 5 (PMP 804) or 10 (PMP 803) patient samples:
1. 2, 5 or 10 Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™devices coated with
directly labelled probes:
Amount of red painting probe: 12-16ng per square
Amount of green painting probe: 36-51ng per square
Amount of blue painting probe: 112-122ng per square
2. 4, 7 or 12 glass slides printed with a special template
3. 500µl Hybridisation Solution (Formamide, Dextran Sulphate, SSC)
4. 1 Cytocell Slide Surface Thermometer
5. 1 Cytocell Chromoprobe Multiprobe®Hybridisation Chamber
Warnings and Precautions
1. For in vitro diagnostic use. For professional use only.
2. Wear gloves when handling Hybridisation solution, DNA probes and DAPI
counterstain.
3. Hybridisation Solution contains formamide, which is a teratogen; do not
breathe fumes or allow skin contact. Wear gloves, a lab coat, and handle in
a fume hood. Upon disposal, flush with a large volume of water.
4. DAPI is a potential carcinogen. Handle with care; wear gloves and a lab
coat. Upon disposal, flush with a large volume of water.
5. Dispose of all hazardous materials according to your institution’s guidelines
for hazardous waste disposal.
6. Operators must be capable of visually distinguishing between red, blue and
green.
7. Failure to adhere to the protocol may affect the performance and lead to
false positive/negative results.
Storage and Handling
The Chromoprobe Multiprobe®kit should be stored at 2-8ºC until the expiry date
indicated on the kit label. Do not freeze.
Equipment and Materials Necessary but not Supplied
1. 500µl Counterstain (DAPI antifade (ES: 0.125µg/ml DAPI (4,6-diamidino-2-
phenylindole)).
2. Hotplate (with a solid plate and accurate temperature control up to 80ºC).
3. Variable volume micropipettes and tips range 1µl - 200µl.
4. Water bath with accurate temperature control at 72ºC.
5. Microcentrifuge tubes (0.5ml).
6. Fluorescence microscope (Please see Fluorescence Microscope
Recommendation section).
7. Plastic or glass coplin jars.
8. Forceps.
9. Fluorescence grade microscope lens immersion oil.
10. Bench top centrifuge.
11. Microscope slides.
12. Timer.
13. 37ºC water bath without stirrer.
Fluorescence Microscope Recommendation
Use a 100-watt mercury lamp and plan apochromat objectives x63 or x100 for
optimal visualisation. Use a triple bandpass filter DAPI/FITC/Texas Red for
optimal visualisation of the green and red fluorophores and DAPI simultaneously.
The aqua fluorophore has specificity to the Aqua and DEAC spectrum (single
bandpass Aqua or DEAC filter is required).
Check the fluorescence microscope before use to ensure it is operating correctly.
Use immersion oil that is suitable for fluorescence microscopy and formulated for
low autofluorescence. Avoid mixing DAPI Antifade with microscope immersion
oil as this will obscure signals. Follow manufacturers’ recommendations in
regards to the life of the lamp and the age of the filters.
Sample Preparation
The Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™ is designed for use on cultured
peripheral blood cells fixed in Carnoy’s fixative that should be prepared according
to the laboratory or institution guidelines.
Prepare air dried samples on Cytocell Chromoprobe Multiprobe®template slides
according to Cytocell’s protocol below. Baking or otherwise ageing slides is not
recommended as it may reduce signal fluorescence.
Chromoprobe Multiprobe®Protocol
Please note: The probes used on the Chromoprobe Multiprobe®device are
directly labelled with fluorophores, which are light sensitive. Ensure that
exposure of the probes to laboratory lights is limited at all times (it is not
necessary to work in the dark).
1. Slide preparation
a) Clean a template slide. Soak the template slide for 2 minutes in 100%
methanol and polish dry with a clean soft tissue.
b) Establish the correct mitotic index. It is important that the intended sample
has a sufficiently high mitotic index to allow detection of chromosome
abnormalities. To check the density of the sample, using a micropipette (e.g.
a Gilson P10 or P20) pipette 4µl of the cell suspension onto one of the areas
of the spare template slide and allow to air dry. The small volume used
means that you usually have to gently touch the slide with the pipette tip to
transfer the suspension. Examine by phase contrast microscopy. If the cell
density is too high, dilute the suspension with fresh fixative. If the mitotic
index is too low, spin down the fixed cell suspension at 160xg for 10 minutes.
Note the volume of supernatant, remove, and re-suspend the cell pellet in a
smaller volume of fresh fixative. If cell sample density has been altered, spot
4µl of the concentrated sample onto another square of your test slide and
re-examine by phase contrast microscopy.
Please Note: 50µl is the minimum volume required for the protocol.
c) Quality control of samples. Samples should be examined for cytoplasm
since this will interfere with the in situ protocol. If the chromosomes appear
to be enclosed by a granular material when examined under phase contrast
microscopy, then this will compromise results. One method for reducing
cytoplasm is to spot 4µl of your sample onto the template slide and watch
the fixative as it spreads out: in the normal situation, the fixative will spread

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to maximum, recede and then evaporate. To clean up any cytoplasm we
have found that effective results are achieved if a fresh drop of fixative is
allowed to fall onto the spot at the point when the spreading fixative has
reached its maximum. Allow the drop of fixative to evaporate and re-examine
the spot.
d) Spotting of the slide. Pipette 4µl of cell suspension onto all 8 areas of the
template slide in a sequence of alternating squares as shown below. This
will prevent the cell spreads from interfering with each other.
e) Once the first group of drops has air-dried, spot the remaining squares with
4µl drops in the same manner. After the slide has dried, examination of the
slide under phase contrast will reveal whether any squares have been
missed. If spots have been missed, or squares have too few cells, simply
spot those squares again: it is not necessary to re-spot a new slide. If upon
examination of the slide, a square has insufficient cells/metaphases, further
drop(s) of suspension can be added to increase the cell density.
Please note: If the metaphases appear overspread, then clean a new template
slide thoroughly in methanol and re-spot allowing every spot to dry before
proceeding to the next.
2. Preparation of the Chromoprobe Multiprobe®device and template
slide
a) Ensure that the Chromoprobe Multiprobe®Hybridisation Chamber is in the
37ºC water bath and allow it to equilibrate to 37ºC (+/- 1ºC). This may take
up to an hour if the water bath has been switched on from cold.
b) Mix the hybridisation solution by repeated pipetting and pre-warm a 25µl
aliquot per device to 37ºC. Also pre-warm each device by placing it on a
37ºC hotplate label side down. Do not touch the raised surfaces of the
device.
c) Immerse template slides containing fixed samples in 2xSSC for 2 minutes
at room temperature (RT) without agitation.
d) Whilst the device is still at 37ºC, dehydrate template slides containing fixed
samples through an ethanol series (2 minutes each in 70%, 85% and 100%)
at RT, air dry and place at 37ºC hotplate to warm up.
e) Add 2µl of pre-warmed hybridisation solution to each of the eight areas on
the pre-warmed device using a P10 micropipette while it remains on a 37ºC
hotplate.
3. Positioning of template slide over the device
a) Carefully invert the template slide over the device such that the number 1,
which is now upside down, is located over the top right hand area of the
device. To help locate square 1 (Chromosomes 3, 15 & 17), its position on
the device has been marked with an orange dot).
b) Make sure that the template slide is carefully aligned with the matching
areas on the device. Carefully lower the slide over the device so that the
drops of hybridisation solution make contact with the slide. Apply gentle,
even pressure to ensure that the hybridisation solution is spread to the
edges of each of the raised areas on the device.
c) Lift the slide carefully holding the frosted end of the glass slide and invert so
that the template slide is underneath the device. Make sure the device does
not smear across the template slide as this could cause cross-contamination
of the probes.
d) Place at 37ºC (+/- 1ºC) (hotplate or incubator) for 10 minutes.
4. Instructions for use of the Cytocell Slide Surface Thermometer
a) The temperature of the 75ºC hotplate should be checked with the Cytocell
Slide Surface Thermometer before proceeding to denaturation.
b) To use the thermometer properly, place it onto the surface of the hotplate
and wait until the different segments stop changing colour. The actual
temperature is indicated by a deep aqua colour.
Please note:
c) When the segments appear granular and the colours no longer appear
uniform and regular, the thermometer should be discarded as it is
exhausted. The life span of each thermometer should, however, easily be
sufficient for a ten-device kit.
d) This thermometer is a liquid crystal device and although reusable, it must be
treated with care to ensure a reasonable life span. The thermometer must
only be used to check the temperature of a hotplate; it must not be used to
monitor the hotplate performance over time.
5. Denaturation
Please note: A PCR thermal cycler-heating block is NOT suitable for use in
place of solid bed hotplate for this procedure.
a) Transfer the slide/device sandwich to the hotplate taking particular care to
hold it level. Ensure the sample slide is in good contact with the hotplate.
b) Denature on the hotplate at 75ºC (+/- 1ºC) for 5 minutes.
6. Hybridisation
Place the slide/device sandwich in the pre-warmed Chromoprobe
Multiprobe®Hybridisation Chamber, replace the lid and float the chamber in
the 37ºC (+/- 1ºC) water bath (non-stirring) overnight.
Please note:
a) Do not seal the lid on the hybridisation chamber.
b) Do not place a lid on the water bath.
c) Do not hybridise in an incubator.
d) Please ensure that the hybridisation chamber is completely dry (i.e. no
water or damp tissue inside the chamber).
The humidity inside the chamber is vital for optimal hybridisation. The
correct levels will be achieved following those steps.
7. Post-hybridisation stringent washes
Please note: Avoid processing more than two slides through the stringency
washes at any one time.
a) Remove the device carefully from the slide.
b) Immerse the slide in 0.4xSSC (pH 7.0) at 72ºC (+/- 1ºC) for 2 minutes
without agitation.
c) Drain the slide and immerse it in 2xSSC, 0.05% Tween-20 at RT (pH 7.0)
for 30 seconds without agitation.
8. Mounting and visualisation of results
a) Drain the slide and apply 20µl of DAPI antifade to each end of the slide.
b) Cover with a coverslip (24x50mm or 24x60mm), remove any bubbles and
allow the colour to develop in the dark for 10 minutes.
c) View with a fluorescence microscope.
Please note: Certain types of microscope have slide holders, which make it
difficult to view the extreme ends of the slide. If this occurs then simply turn the
slide through 180, which will help with the viewing of the slide.
Stability of Finished Slides
FISHed slides remain analysable for up to 1 month if stored in the dark at/or
below RT.
Procedural Recommendations
1. Baking or ageing of slides may reduce signal fluorescence
2. Hybridisation conditions may be adversely affected by the use of reagents
other than those provided or recommended by Cytocell Ltd.
3. Use a calibrated thermometer for measuring temperatures of solutions,
waterbaths and incubators as these temperatures are critical for optimum
product performance.
4. The wash concentrations, pH and temperatures are important as low
stringency can result in non-specific binding of the probe and too high
stringency can result in a lack of signal.
5. Incomplete denaturation can result in lack of signal and over denaturation
can also result in non-specific binding.
6. Over hybridisation can result in additional or unexpected signals.
7. Users should optimise the protocol for their own samples prior to using the
test for diagnostic purposes.
8. Slides should be independently scored by two analysts.
9. Suboptimal conditions may result in non-specific binding that may be
misinterpreted as a probe signal.
Expected Results
1. The acrocentric chromosome painting probes contain short arm material.
This is shared between the D & G group chromosomes, so cross-
hybridisation in these regions may be observed.
2. The chromosome 16 whole chromosome painting probe may show faint
cross-hybridisation to the heterochromatic regions of chromosome Y.
3. The Y chromosome painting probe contains the pseudoautosomal regions
common with the X chromosome. Consequently, cross-hybridisation may be
observed in these regions.
4. Chromosomes 1, 5 and 19 have centromeric DNA sequences in common.
Consequently cross-hybridisations in these regions may be observed
between these chromosomes.
5. Chromosome 1 whole chromosome painting probe may show a brighter
signal at 1p36.
6. Whole chromosome painting probes do not cover the Heterochromatic
blocks in chromosomes 1, 9 and 16.
Limitations
Reporting and interpretation of FISH results should be consistent with
professional standards of practice and should take into consideration other
clinical and diagnostic information. This kit is intended as an adjunct to other
diagnostic laboratory tests and therapeutic action should not be initiated on the
basis of the FISH result alone.
Failure to adhere to the protocol may affect the performance and lead to false
positive/negative results.
This kit has not been validated for purposes outside of the intended use stated.
Additional Information
For additional product information please contact the Cytocell Technical
Support Department.
T: [phone]
E: [e-mail]
W: www.cytocell.com
FRANÇAIS
L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) est une technique qui permet de détecter des
séquences ADN sur les chromosomes en métaphase ou sur les noyaux interphasiques

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d’échantillons cytogénétiques fixés cultivés ou non cultivés. La technique utilise des sondes
ADN qui s’hybrident auxchromosomes entiers ou à des séquences spécifiques, et sert de test
complémentaire à la cytogénétique classique. De récents développements ont démontré que
cette technique informative peut maintenant être utilisée comme un outil diagnostic essentiel
lors de l’analyse des chromosomes en prénatal, hématologie et pathologie. L’ADN cible, après
fixation, est traité par la chaleur et à la formamide pour dénaturer la double hélice, la rendant
simple hélice. L’ADN cible est alors disponible pour hybridation avec une sonde ADN
complémentaire simple brin, dénaturée de la même manière et marquée avec un
fluorochrome. Après l’hybridation, l’ADN non hybridé et l’ADN non lié spécifiquement sont
éliminés par une série de lavages stringents et l’ADN est ensuite contre-coloré. Un microscope
à fluorescence permet ensuite la visualisation de la sonde hybridée sur l’ADN cible.
Informations sur les sondes
Le panel Chromoprobe Multiprobe®Octochrome™de Cytocell combine le principe d’un
dispositif Multiprobe à 8 cases et l’ensemble des sondes peintures chromosomiques
(marquées en 3 couleurs différentes), pour permettre l’identification des 24 chromosomes sur
une seule lame. Le dispositif Octochrome™permet l’analyse simultanée du génome entier
sur une seule lame en une seule hybridation.
Caractéristiques de la sonde
Chaque case du dispositif Octochrome™contient l’ensemble des sondes peintures
chromosomiques pour trois chromosomes différents, chacune des 3 sondes étant marquées
avec un fluorochrome de couleur différente, rouge, vert et bleu (spectres Texas Red, FITC et
Aqua/DEAC respectivement), qui sont visibles simultanément avec un filtre triple passe-bande
DAPI/FITC/Texas ou des filtres individuels spécifiques.
La disposition des combinaisons chromosomiques sur le dispositif Octochrome™a été
conçue pour faciliter l’identification des réarrangements chromosomiques non aléatoires
présents dans les leucémies les plus courantes (figure 1).
Le dispositif Octochrome™ est prévu pour une hybridation in situ avec des sondes
fluorescentes, effectuée sur des chromosomes métaphasiques provenant de cellules de sang
périphérique cultivées et fixées.
Figure 1. Emplacement des sondes sur le Multiprobe Chromoprobe®OctoChrome™.
Conditionnement
Chaque trousse contient les réactifs nécessaires pour tester 2 (PMP 802), 5 (PMP 804) ou
10 (PMP 803) échantillons de patient :
1. 2, 5 ou 10 dispositifs Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™ coatés avec des sondes
de peinture directement marquées.
Quantité de sonde de peinture marquée en rouge : 2,5-5ng par case
Quantité de sonde de peinture marquée en vert : 7,5-12,5ng par case
Quantité de sonde peinture marquée en bleu : 15-25ng par case
2. 4, 7 ou 12 lames en verre imprimées avec un motif particulier.
3. 500µl de solution d'hybridation (formamide, sulfate de dextrane, SSC)
4. 1 thermomètre de surface (Cytocell Slide Surface Thermometer)
5. 1 chambre d’hybridation Cytocell Chromoprobe Multiprobe®
Avertissements et précautions
1. Pour des applications de diagnostic in vitro. Pour une utilisation professionnelle
uniquement.
2. Portez des gants lors de la manipulation de lasolution d'hybridation, des sondes DNA et
de contre-colorant DAPI.
3. La solution d'hybridation contient du formamide, qui est tératogène. N'inhalez pas les
vapeurs et évitez tout contact avec la peau. Portez des gants et une blouse de
laboratoire, et manipulez sous une hotte. Lors de la mise au rebut, rincez avec une
grande quantité d'eau.
4. Le DAPI est potentiellement cancérigène. Manipulez-le avec précaution; portez des
gants et une blouse de laboratoire. Lors de la mise au rebut, rincez avec une grande
quantité d'eau.
5. Mettez au rebut toutes les matières dangereuses conformément aux directives de votre
institution en matière de mise au rebut des déchets dangereux.
6. Visuellement, les opérateurs doivent être en mesure de faire la différence entre le rouge,
le bleu et le vert.
7. Si le protocole n’est pas respecté, la performance peut être affectée et des résultats
erronés/positifs/négatifs peuvent être obtenus.
Conservation et manipulation
La trousse Chromoprobe Multiprobe®doit être conservée entre 2 et 8ºC jusqu'à la date de
péremption indiquée sur l’étiquette de la trousse. Ne pas congeler.
Équipement et matériaux nécessaires mais non fournis
1. 500µl de contre-colorant (DAPI antifade (ES: 0,125µg/mL DAPI (4,6-diamidino-2-
phénylindole))).
2. Plaque chauffante (avec bloc et contrôle de la température jusqu’à 80ºC).
3. Micropipettes 1µl - 200µl.
4. Bain-marie avec contrôle de la température à 72ºC.
5. Tubes à microcentrifugation (0.5ml).
6. Microscope à fluorescence (Voir la section Microscope et filtres).
7. Jarres en plastique ou en verre.
8. Forceps.
9. Huile à immersion pour microscope à fluorescence.
10. Centrifugeuse de paillasse.
11. Lamelles en verre pour fluorescence (24 x 50 mm)
12. Chronomètre.
13. Bain-marie à 37ºC sans agitateur.
Microscope et filtres
Utilisez une lampe au mercure de 100-watts et planifiez des objectifs apochromatiques de x63
ou x100 pour une visualisation optimale. Utilisez un filtre passe-bande triple DAPI/FITC/Texas
Red pour une visualisation optimale et simultanée des fluorophores verts et rouges et DAPI.
L'aqua fluorophore a une spécificité pour le spectre Aqua et DEAC (un filtre passe-bande
unique Aqua ou DEAC est requis).
Contrôlez le microscope à fluorescence avant toute utilisation pour vous assurer qu'il
fonctionne correctement. Utilisez une huile d'immersion appropriée pour la microscopie à
fluorescence et formulée pour l'autofluorescence faible. Évitez de mélanger la solution DAPI
Antifade avec de l'huile d'immersion pour microscope, car cela assombrit les signaux. Suivez
les recommandations du fabricant relatives à la durée de vie de la lampe et des filtres.
Préparation des échantillons
La trousse Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™estconçue pour une utilisation sur des
cellules de sang périphérique cultivées, fixées avec le fixateur de Carnoy et devant être
préparées selon les protocoles en vigueur dans le laboratoire ou l’institution.
Préparer les échantillons séchés à l’air sur les lames échantillons Cytocell Chromoprobe
Multiprobe®selon le protocole Cytocell ci-dessous. La cuisson ou le vieillissement des
lames n’est pas recommandé, ceci pouvant réduire l’intensité du signal fluorescent.
Protocole Chromoprobe Multiprobe®
Remarque : les sondes utilisées pour le dispositif Chromoprobe Multiprobe®sont
directement marquées avec des fluorophores photosensibles. S'assurer que l’exposition
des sondes aux lumières du laboratoire est limitée en permanence (il n'est pas nécessaire
de travailler dans l’obscurité).
1. Préparation des lames
a) Nettoyage d’une lame échantillon. Plonger la lame échantillon dans un bain méthanol
100% pendant 2 minutes et sécher avec un tissu doux.
b) Définir l’index mitotique correct. Il est important que l’échantillon ait un index mitotique
élevé afin de permettre la détection d’anomalies chromosomiques. Pour vérifier la
densité de l’échantillon, utiliser une micropipette (par exemple, Gilson P10 ou P20),
pipeter 4μl de suspension cellulaire et déposer sur l’une des surfaces de la lame
échantillon de réserve, puis laisser sécher à l’air. Vu le petit volume utilisé, vous devez
généralement toucher légèrement la lame avec l’embout de la pipette pour transférer
la suspension. Examiner avec un microscope à contraste de phase. Si la densité
cellulaire est trop élevée, diluer la suspension avec du fixateur frais. Si l’index
mitotique est trop faible, centrifuger la suspension de cellules fixées à 160g pendant
10 minutes. Noter le volume de surnageant, éliminer le et resuspendre le culot
cellulaire dans un plus faible volume de fixateur frais. Si la densité de l’échantillon
cellulaire a été modifiée, déposer 4µl de l’échantillon concentré sur une autre case de
votre lame d’essai, et vérifier de nouveau au microscope à contraste de phase.
Remarque : un volume minimum de 50μl est requis par le protocole.
c) Contrôle de la qualité des échantillons. Les échantillons doivent être examinés afin de
s’assurer de l’absence de cytoplasme, celui-ci pouvant perturber le protocole in situ. Si
les chromosomes semblent être enveloppés par une substance granulaire lors de
l’examen au microscope à contraste de phase, les résultats seront compromis. Une
méthode pour réduire le cytoplasme consiste à déposer 4μl d’échantillon sur la lame
échantillon et observer la façon dont le fixateur s’étale. Normalement, le fixateur
s’étale au maximum, se rétracte, puis s’évapore. Pour éliminer le cytoplasme, nous
avons constaté que des résultats efficaces sont obtenus si l’on dépose une goutte de
fixateur frais sur le dépôt lorsque l’étalement du fixateur est maximal. Laisser la goutte
de fixateur s’évaporer et examiner de nouveau le dépôt.
d) Dépôt sur la lame. Pipeter et déposer 4µl de suspension cellulaire sur chacune des
8 cases de la lame échantillon, selon un motif en quinconce comme illustré ci-
dessous. Ceci évitera que les gouttes de suspension cellulaire interfèrent entre elles
lors de leur étalement.
e) Lorsque le premier groupe de gouttes a séché, déposer de la même façon 4μl de
suspension cellulaire dans les cases restantes. Lorsque la lame est sèche, un examen
de la lame en contraste de phase permettra de s’assurer qu’aucune case n’a été
oubliée. S’il manque des gouttes, ou si des cases comportent trop peu de cellules,
redéposer simplement d’autres gouttes sur ces cases. Il n'est pas nécessaire de
repréparer une nouvelle lame. Si après examen de la lame, une case ne présente pas
suffisamment de cellules/métaphases, il est possible de redéposer d’autres gouttes de
suspension afin d’augmenter la densité cellulaire.
Remarque : si les métaphases semblent sur-étalées, nettoyer complètement une nouvelle
lame échantillon dans du méthanol et effectuer un nouveau dépôt, puis laisser sécher
chaque goutte avant de passer au dépôt suivant.
2. Préparation du dispositif Chromoprobe Multiprobe®et de la lame échantillon
a) Vérifier que la chambre d’hybridation Chromoprobe Multiprobe®se trouve dans un
bain-marie à 37ºC et laisser équilibrer à 37ºC (+/- 1ºC). Ceci peut prendre jusqu'à une
heure au maximum si le bain-marie était froid au départ.
b) Mélanger la solution d'hybridation en pipetant plusieurs fois et préchauffer un aliquote
de 25µl par dispositif à 37ºC. Préchauffer également chaque dispositif en le plaçant
sur une plaque chauffante à 37ºC et en vérifiant que l’étiquette est placée au-dessous.
Ne pas toucher les surfaces hautes du dispositif.
c) Plonger les lames comportant les échantillons fixés dans du tampon 2xSSC pendant
2 minutes, à température ambiante sans agitation.
d) Alors que le dispositif est toujours à 37ºC, déshydrater les lames comportant les
échantillons fixés dans une série de bains d’éthanol (2 minutes dans chaque bain,
70%, 85% et 100%) à température ambiante, laisser sécher à l’air et placer sur la
plaque chauffante à 37ºC pour démarrer.
e) Ajouter 2µl de solution d'hybridation préchauffée sur chacune des 8 cases du dispositif
préchauffé à l'aide d’une micropipette P10 pendant que celui-ci est encore sur la
plaque chauffante à 37ºC.
3. Positionnement de la lame échantillon sur le dispositif
e) Retourner délicatement la lame échantillon sur le dispositif, de telle sorte que la case
numéro 1, qui est à présent inversée, soit positionnée en haut et à droite du dispositif
Pour faciliter la localisation de la case 1 (Chromosomes 3, 15 & 17), sa position sur le
dispositif a été marquée avec un point orange
b) Veillez à ce que la lame échantillon soit bien alignée sur les cases complémentaires
du dispositif. Appliquer délicatement la lame sur le dispositif afin que les gouttes de
solution d'hybridation entrent en contact avec la lame. Appuyer légèrement en

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exerçant la même pression, afin de garantir que la solution d'hybridation est étalée sur
les bords de chacune des surfaces hautes du dispositif.
c) Soulever délicatement la lame en tenant l’extrémité dépolie de la lame de verre et
retourner afin que la lame échantillon soit en dessous du dispositif. S'assurer que le
dispositif ne glisse pas sur la lame échantillon, car ceci pourrait entraîner des
contaminations croisées entre les sondes.
d) Placer à 37ºC (+/- 1ºC) (plaque chauffante ou incubateur) pendant 10 minutes.
4. Mode d'emploi du thermomètre Cytocell Slide Surface Thermometer
a) La température de la plaque chauffante (75ºC) doit être vérifiée avec le thermomètre
Cytocell Slide Surface Thermometer avant de procéder à l’étape de dénaturation.
b) Pour utiliser le thermomètre correctement, le placer sur la surface de la plaque
chauffante et attendre que les différents segments cessent de changer de couleur. La
bonne température est indiquée par une couleur vert opale.
Remarque :
c) Si les segments apparaissent granuleux et de couleur non uniforme et non régulière,
le thermomètre doit être jeté, car il est usé. Toutefois, la durée de vie de chaque
thermomètre devrait être bien suffisante pour l’utilisation d’une trousse de 10 tests.
d) Ce thermomètre est un dispositif à cristaux liquides et bien que réutilisable, il doit être
manipulé avec précaution pour garantir une durée de vie raisonnable. Le thermomètre
ne doit être utilisé que pour vérifier la température d’une plaque chauffante ; il ne doit
pas être utilisé pour surveiller le fonctionnement de la plaque chauffante à mesure que
le temps passe.
5. Dénaturation
Remarque : un bloc chauffant de thermocycleur PCR NE peut PAS être utilisé pour
remplacer une plaque chauffante en lit fixe pour ce protocole.
a) Transférer l’ensemble lame/dispositif sur la plaque chauffante en faisant bien attention
de la maintenir horizontalement. S’assurer que la lame échantillon est bien en contact
avec la plaque chauffante.
b) Dénaturer sur la plaque chauffante à 75ºC (+/- 1ºC) pendant 5 minutes.
6. Hybridation
Placer l’ensemble lame/dispositif dans la chambre d’hybridation Chromoprobe Multiprobe®,
remettre le couvercle et laisser flotter la chambre dans un bain-marie à 37ºC (+/- 1ºC) (sans
agitation) pendant une nuit.
Remarque :
a) Ne pas sceller le couvercle de la chambre d’hybridation.
b) Ne pas placer un couvercle sur le bain-marie.
c) Ne pas hybrider dans un incubateur.
d) Veuillez vous assurer que la chambre d’hybridation est bien sèche (c’est-à-dire,
aucune eau ou tissu humide à l’intérieur de la chambre).
L’humidité à l'intérieur de la chambre est cruciale pour une hybridation optimale. Les
taux corrects seront obtenus en suivant ces étapes.
7. Lavages stringents de post-hybridation
Remarque : éviter de traiter plus de 2 lames à la fois lors de l’étape de lavages stringents.
a) Retirer délicatement le dispositif de la lame.
b) Plonger la lame dans un tampon 0,4xSSC (pH 7,0) à 72ºC (+/- 1ºC) pendant 2
minutes, sans agitation.
c) Égoutter la lame et la plonger dans un tampon 2xSSC, Tween-20 à 0,05% à
température ambiante (pH 7,0) pendant 30 secondes, sans agitation.
8. Montage et visualisation des résultats
a) Égoutter la lame et déposer 20µl de DAPI antifade sur chaque extrémité de la lame.
b) Couvrir avec une lamelle (24 x 50mm), éliminer toute bulle et laisser la couleur se
développer dans l’obscurité pendant 10 minutes.
c) Visualiser avec un microscope à fluorescence.
Remarque : certains types de microscope sont équipés de porte-lame, ce qui peut
compliquer la visualisation des extrémités de la lame. Si c’est le cas, tourner simplement la
lame de 180º pour en faciliter la vue.]
Stabilité des lames
Les lames FISH sont analysables pendant un mois si elles sont conservées à l’obscurité et
à/ou au-dessous de la température ambiante.
Recommandations
1. La cuisson ou le vieillissement des diapositives peut réduire la fluorescence du signal.
2. Les conditions d'hybridation peuvent être affectées négativement si des réactifs autres
que ceux fournis ou recommandés par Cytocell Ltd. sont utilisés.
3. Utilisez un thermomètre étalonné pour mesurer les températures des solutions, des
bains d’eau et des incubateurs, car ces températures sont essentielles à la performance
optimale du produit.
4. La concentration, le pH et la température de la solution de rinçage sont importants car
une faible stringence peut entraîner une liaison non spécifique de la sonde et une
stringence trop élevée peut entraîner une absence de signal.
5. Une dénaturation incomplète peut entraîner une absence de signal et une dénaturation
trop élevée peut entraîner également une liaison non spécifique.
6. Une dénaturation trop élevée peut générer des signaux supplémentaires ou inattendus.
7. Avant toute utilisation du test à des fins de diagnostic, les utilisateurs devront optimiser
le protocole pour leurs propres échantillons.
8. Les diapositives devront être notées indépendamment par deux analystes.
9. Des conditions sous-optimales peuvent entraîner une liaison non spécifique susceptible
d'être interprétée comme un signal de la sonde.
Résultats attendus
1. Les sondes de peinture des chromosomes acrocentriques comportent du matériel de
bras court, partagé entre les chromosomes des groupes D et G, de sorte qu’une
hybridation croisée peut être constatée dans ces régions.
2. La sonde de peinture de chromosome entier spécifique du chromosome 16 peut
présenter une faible hybridation croisée dans les régions hétérochromatiques du
chromosome Y.
3. La sonde de peinture spécifique du chromosomeY contient les régions
pseudoautosomales communes avec le chromosomeX. Par conséquent, une
hybridation croisée peut être observée dans ces régions.
4. Les chromosomes1, 5 et 19 possèdent en commun des séquences d’ADN
centromérique. Par conséquent, des hybridations croisées peuvent être observées
entre ces chromosomes.
5. La sonde de peinture de chromosome entier spécifique du chromosome 1 peut présenter
un signal plus intense en 1p36.
6. Les sondes de peinture de chromosome entier ne couvrent pas les blocs
hétérochromatiques des chromosomes 1, 9 et 16.
Limitations
Le signalement et l'interprétation des résultats FISH doivent être conformes aux normes de
pratique professionnelle et doivent tenir compte des autres informations cliniques et
diagnostiques. Ce kit tient lieu de succédané aux autres tests diagnostics de laboratoire et
aucune action thérapeutique ne doit être initiée sur la base des résultats FISH uniquement.
Si le protocole n’est pas respecté, la performance peut être affectée et des résultats
erronés/positifs/négatifs peuvent être obtenus.
Ce kit n'a pas été validé pour une utilisation en dehors du cadre prévu et indiqué.
Informations supplémentaires
Pour plus d’informations sur le produit, veuillez contacter l’Assistance technique Cytocell.
T: [phone]
E: [email protected]
W: www.cytocell.com
ITALIANO
Introduzione
L'ibridazione in situ in fluorescenza (Fluorescence In Situ Hybridisation - FISH) è una tecnica
che permette di rilevare sequenze di DNA su cromosomi in metafase o in nuclei in interfase di
campioni citogenetici fissati, o in coltura dopo prelievo. La tecnica prevede l'utilizzo di sonde
di DNA in grado di ibridare con l'intero cromosoma o con singole sequenze. La FISH
costituisce quindi un potente strumento in aggiunta alle tecniche citogenetiche classiche.
Recenti sviluppi hanno reso possibile che questa preziosa tecnica può ora essere applicata
come strumento diagnostico essenziale nell’analisi cromosomica prenatale, ematologia e
patologica. Il DNA bersaglio, dopo la fissazione, è sottoposto a denaturazione al calore in
presenza di formamide. Il DNA bersaglio è così disponibile per l’annealing con una sonda di
DNA a singola elica a sequenza complemetare, marcata con una sostanza fluorescente.
Terminata l’ibridazione, la sonda di DNA non legata o legata in modo non specifico, è rimossa
per mezzo di lavaggi stringenti ed il DNA è in seguito colorato con un colorante di contrasto.
L’ibridazione della sonda viene infine analizzata con un microscopio a fluorescenza.
Informazioni sulle sonde
Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™Cytocell unisce l'utilità di un dispositivo Multiprobe
a 8 quadrati all'intera sonda cromosomica painting (marcata in 3 diversi colori), per consentire
di identificare tutti e 24 i cromosomi su un singolo vetrino. Il dispositivo OctoChrome™
consente l'analisi simultanea dell'intero genoma su un vetrino in un'ibridazione.
Informazioni sulle sonde
Ciascun quadrato del dispositivo OctoChrome™porta intere sonde cromosomiche painting
per tre diversi cromosomi in tre diversi colori di fluorofori, rosso, verde e blu (rispettivamente
spettro Texas Red, FITC e Aqua/DEAC) che sono visibili contemporaneamente con un triplo
filtro DAPI/FITC/Texas Red o singoli filtri specifici.
L'arrangiamento delle combinazioni cromosomiche del dispositivo OctoChrome™è stato
concepito per facilitare l'identificazione dei riarrangiamenti cromosomici non-random trovati
nelle leucemie più comuni (Figura 1).
Il dispositivo OctoChrome™ è destinato per FISH su cromosomi in metafase da cellule del
sangue periferico coltivate fissate.
Figura 1. Posizione delle sonde sul Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™.
Ogni kit contiene i seguenti reagenti, sufficienti per 2 (PMP 802), 5 (PMP 804) o 10 (PMP 803)
campioni del paziente:
1. 2, 5 o 10 dispositivi Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™ rivestiti con sonde
painting marcate direttamente.
Quantità di sonda painting rossa: 2,5-5ng per quadrato
Quantità di sonda painting verde: 7,5-12,5ng per quadrato
Quantità di sonda painting blu: 15-25ng per quadrato
2. 4, 7 o 12 vetrini con impresso uno stampo specifico
3. 500µl di soluzione di ibridizzazione (formamide, destrano solfato, SSC)
4. 1 termometro di superficie per vetrini Cytocell
5. 1 camera di ibridizzazione Chromoprobe Multiprobe®Cytocell
Avvertenze e misure precauzionali
1. Per uso diagnostico in vitro. Solo per uso professionale.
2. Indossare i guanti durante la manipolazione della soluzione di ibridazione, delle sonde
di DNA e della colorazione di contrasto DAPI.
3. La soluzione di ibridazione contiene formammide, che è un teratogeno; non inalare i
fumi ed evitare il contatto con la pelle. Indossare guanti, camice da laboratorio e
manipolare in una cappa aspirante. Per lo smaltimento, sciacquare abbondantemente
con acqua.
4. DAPI è un potenziale cancerogeno. Maneggiare con cura; indossare guanti e camice
da laboratorio. Per lo smaltimento, sciacquare abbondantemente con acqua.
5. Lo smaltimento dei materiali pericolosi deve avvenire nel rispetto delle normative
interne relative allo smaltimento dei rifiuti pericolosi.
6. Gli operatori devono essere in grado di distinguere visivamente tra rosso, blu e verde.
7. Il mancato rispetto del protocollo può influire sulle prestazioni e generare risultati
falsi positivi o falsi negativi.
Conservazione e utilizzo
Il kit Chromoprobe Multiprobe®deve essere conservato a 2-8ºC fino alla data di scadenza
indicata sull’etichetta. Non congelare.
Attrezzature e materiali richiesti ma non in dotazione
1. 500µl di controcolorante (antifade DAPI (ES: 0,125µg/ml di DAPI (4,6-diamidino-2-
fenilindolo))).
2. Piastra riscaldante (con - un controllo accurato della temperatura fino ad 80ºC).
3. Micropipette a volume variabile compreso tra 1µl - 200µl.
4. Bagno termostatato con controllo accurato della temperatura a 72ºC.
5. Provette da microcentrifuga (0,5ml).
6. Microscopio a fluorescenza (riferirsi alla sezione Configurazione ottimale del
microscopio e dei filtri).
7. Contenitori di Coplin in plastica o vetro.
8. Pinzette.

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9. Olio per lenti ad immersione del microscopio a fluorescenza.
10. Centrifuga da banco
11. .Vetrini coprioggetto per microscopio a fluorescenza (24 x 50 mm)
12. Timer.
13. Bagnomaria a 37ºC senza agitatore.
Configurazione ottimale del microscopio e dei filtri
Per una visualizzazione ottimale, utilizzare una lampada al mercurio da 100-W e obiettivi
apocromatici piani di tipo x63 o x100. Per una visualizzazione ottimale e simultanea dei
fluorofori rossi e verdi e DAPI, utilizzare un filtro passa banda triplo DAPI/FITC/Texas Red. Il
fluoroforo dell’acqua ha una specificità allo spettro Aqua e DEAC (è richiesto un filtro passa
banda singolo Aqua o DEAC).
Prima dell’uso, verificare il corretto funzionamento del microscopio a fluorescenza. Utilizzare
olio da immersione adatto per microscopia a fluorescenza e formulato per bassa auto-
fluorescenza. Evitare di mischiare la soluzione DAPI Antifade con l’olio da immersione per
microscopio poiché questo oscura i segnali. Seguire le raccomandazioni dei produttori relative
alla durata della lampada e all’età dei filtri.
Preparazione del campione
Il Chromoprobe Multiprobe® OctoChrome™- è destinatoall’uso su cellule di sangue periferico
in coltura fissate con fissativo di Carnoy da preparare seguendo le linee guida del laboratorio
o dell’istituzione.
Preparare i campioni asciugati all’aria sui vetrini a stampo del Chromoprobe Multiprobe®
Cytocell in conformità con il protocollo Cytocell riportato qui sotto. Si sconsiglia di essiccare a
caldo o processare altrimenti i vetrini in quanto si potrebbe ridurre la fluorescenza del segnale.
Protocollo Chromoprobe Multiprobe®
N.B.: le sonde utilizzate con il dispositivo Chromoprobe Multiprobe®sono marcate
direttamente con fluorofori, che sono sensibili alla luce. Verificare che in ogni fase venga
limitata l’esposizione delle sonde alle luci del laboratorio (non è necessario lavorare al buio).
1. Preparazione del vetrino
a) Pulire un vetrino a stampo. Immergerlo per 2 minuti in metanolo al 100% e asciugarlo
minuziosamente con un panno morbido pulito.
b) Determinare l’indice mitotico corretto. È importante che i campioni designati abbiano un
indice mitotico sufficientemente alto da consentire la rilevazione della anomalie
cromosomiche. Per verificare la densità del campione, pipettare con una micropipetta
(es. una Gilson P10 o P20) 4µl della sospensione cellulare su una delle aree del vetrino
a stampo vuoto e lasciare asciugare all'aria. Vista l’entità minima del volume utilizzato,
di solito per trasferire la sospensione sarà necessario toccare delicatamente il vetrino
con la punta della pipetta. Esaminare al microscopio a contrasto di fase. Se la densità
cellulare è troppo elevata, diluire la sospensione con dell’altro fissativo. Se l’indice
mitotico è troppo basso, centrifugare a bassa velocità la sospensione cellulare fissata a
160g per 10 minuti. Osservare il volume del surnatante, rimuoverlo e risospendere il
pellet cellulare in un volume inferiore di fissativo. Se la densità del campione cellulare è
stata modificata, trasferire 4µl del campione concentrato in un altro riquadro del vetrino
per il test e riesaminarlo al microscopio a contrasto di fase.
N.B.: 50 µl è il volume minimo necessario per il protocollo.
c) Controllo della qualità dei campioni. Si deve verificare l’eventuale presenza di citoplasma
nei campioni, che interferirebbe con il protocollo in situ. Se all’osservazione al
microscopio a contrasto di fase i cromosomi appaiono circondati da materiale granulare,
i risultati del test saranno compromessi. Un metodo per ridurre la presenza di citoplasma
è trasferire 4µl del campione sul vetrino a stampo e osservare la propagazione del
fissativo. In condizioni normali, il fissativo raggiunge un’espansione massima, si ritira e
quindi evapora. Per ripulire efficacemente il campione da eventuali tracce di citoplasma,
un sistema efficace consiste nel lasciare cadere una goccia di fissativo sul campione nel
momento in cui il fissativo in espansione ha raggiunto il suo massimo. Lasciare
evaporare la goccia di fissativo e riesaminare il campione.
d) Trasferimento sul vetrino. Pipettare 4µl di sospensione cellulare su tutte le 8 aree del
vetrino a stampo procedendo su riquadri alternati come indicato qui sotto. Così facendo
si eviterà che l’espansione delle cellule provochi interferenze reciproche.
e) Una volta che la prima serie di gocce si è asciugata all’aria, trasferire gocce da 4µl nei
riquadri ancora vuoti, con la stessa modalità. Dopo che il vetrino si è asciugato,
osservandolo al microscopio a contrasto di fase si potrà verificare se tutti i riquadri sono
stati riempiti. Se così non fosse, o se qualche riquadro contenesse un numero
insufficiente di cellule, basterà ripetere il trasferimento su questi riquadri: non è
necessario ripetere il trasferimento su un altro vetrino. Se esaminando il vetrino si
notasse un riquadro con un numero insufficiente di cellule o di metafasi, aggiungere
una o più gocce di sospensione per aumentare la densità cellulare.
N.B.: se le metafasi appaiono troppo diffuse, pulire accuratamente un nuovo vetrino astampo
in metanolo ed effettuare un nuovo trasferimento facendo asciugare ogni goccia prima di
procedere con la successiva.
2. Preparazione del dispositivo Chromoprobe Multiprobe®e del vetrino a stampo
a) Accertarsi che la Camera di ibridizzazione Chromoprobe Multiprobe®sia nel bagnomaria
a 37ºC e lasciare che si equilibri a 37ºC (+/- 1ºC). Se il bagnomaria è stato acceso con
acqua fredda potrebbe essere necessaria anche un'ora.
b) Miscelare la soluzione di ibridizzazione pipettando ripetutamente e preriscaldare a 37ºC
un'aliquota da 25µl per dispositivo. Pre-riscaldare inoltre ogni dispositivo ponendolo su
una piastra a 37ºC con l'etichetta rivolta verso il basso. Non toccare le superfici in rilievo
del dispositivo.
c) Immergere i vetrini a stampo contenenti i campioni fissati in 2xSSC per 2 minuti a
temperatura ambiente (TA) senza agitare.
d) Mentre il dispositivo è ancora a 37ºC, disidratare i vetrini a stampo contenenti i campioni
fissati con diluizioni di etanolo in serie (70%, 85% e 100%, 2 minuti ciascuno) a TA,
asciugare all’aria e riscaldare su una piastra a 37ºC.
e) Aggiungere, con una micropipetta P10, 2µl di soluzione di ibridizzazione preriscaldata a
ognuna delle 8 aree presenti sul dispositivo preriscaldato, mentre è ancora sulla piastra
a 37ºC.
3. Posizionamento del vetrino a stampo sul dispositivo
a) Capovolgere con cura il vetrino a stampo sul dispositivo in modo che il numero 1, che
ora è a testa in giù, si trovi sopra l'area in alto a destra del dispositivo Per facilitare la
localizzazione del riquadro numero 1 (Cromosomi 3, 15 & 17), la sua posizione sul
dispositivo è stato contrassegnato con un punto arancione).
b) Verificare il preciso allineamento del vetrino a stampo con le corrispondenti aree del
dispositivo. Abbassare con cura il vetrino sul dispositivo in modo che le gocce di
soluzione di ibridizzazione entrino in contatto con il vetrino. Applicare una pressione
leggera ed uniforme per fare sì che la soluzione di ibridizzazione diffonda fino ai margini
di ciascuna delle aree in rilievo del dispositivo.
c) Sollevare con cura il vetrino tenendolo per l'estremità smerigliata e capovolgerlo in modo
che il vetrino stesso si trovi al di sotto del dispositivo. Accertarsi che il dispositivo non
strisci lungo il vetrino a stampo, causando la contaminazione crociata delle sonde.
d) Porre su una piastra o un incubatore a 37ºC (+/- 1ºC) per 10 minuti.
4. Istruzioni per l’uso del termometro di superficie per vetrini Cytocell
a) Prima di procedere alla denaturazione, con il termometro di superficie per vetrini Cytocell
controllare che la temperatura della piastra sia di 75ºC.
b) Per utilizzare il termometro in modo appropriato, posizionarlo sulla superficie della piastra
e attendere che i diversi segmenti smettano di cambiare colore. La temperatura effettiva
è indicata da un colore turchese intenso.
N.B.:
c) Quando i segmenti hanno un aspetto granulare ed i colori non sono più uniformi e
regolari, il termometro deve essere eliminato perché esaurito. La durata di ogni
termometro, tuttavia, dovrebbe essere sufficiente per un kit da 10 dispositivi.
d) Il termometro è un dispositivo a cristalli liquidi e, benché riutilizzabile, deve essere trattato
con cura per garantire una durata adeguata. Il termometro deve essere utilizzato solo
per controllare la temperatura delle piastre, non per effettuare il monitoraggio delle loro
prestazioni nel tempo.
5. Denaturazione
N.B.: per questa procedura NON è possibile utilizzare un blocco riscaldante del
termociclatore per la PCR al posto di una piastra solida.
a) Trasferire sulla piastra l’insieme vetrino/dispositivo facendo molta attenzione a tenerlo in
posizione orizzontale. Verificare che il vetrino con i campioni sia bene a contatto con la
piastra.
b) Denaturare sulla piastra a 75ºC (+/- 1ºC) per 5 minuti.
6. Ibridizzazione
Porre l’insieme vetrino/dispositivo nella camera di ibridizzazione Chromoprobe Multiprobe®
preriscaldata, riposizionare il coperchio e far flottare la camera nel bagnomaria a 37ºC
(+/- 1ºC) (senza agitazione) per tutta la notte.
N.B.:
a) Non sigillare il coperchio sulla camera di ibridizzazione.
b) Non chiudere il bagnomaria con un coperchio.
c) Non effettuare l’ibridizzazione in un incubatore.
d) Accertarsi che la camera di ibridizzazione sia completamente asciutta (cioè che
all'interno della camera non vi siano acqua o panni umidi).
Il livello di umidità all'interno della camera è essenziale per una ibridizzazione
ottimale. Per ottenere i livelli corretti procedere come indicato qui sotto.
7. Lavaggi stringenti post-ibridizzazione
N.B.: non sottoporre alla procedura dei lavaggi stringenti più di due vetrini per volta.
a) Rimuovere con cura il dispositivo dal vetrino.
b) Immergere il vetrino in 0,4xSCC (pH 7,0) a 72ºC (+/- 1ºC) per 2 minuti senza agitare.
c) Fare sgocciolare il vetrino e immergerlo in 2xSCC, 0,05% Tween-20 a TA (pH 7,0) per
30 secondi senza agitare.
8. Montaggio e visualizzazione dei risultati
a) Fare sgocciolare il vetrino e applicare a ogni estremità 20µl di antifade DAPI.
b) Coprire con un coprioggetto (24 x 50mm), rimuovere eventuali bolle e lasciare che il
colore si sviluppi al buio per 10 minuti.
c) Osservare con un microscopio a fluorescenza.
N.B.: alcuni microscopi hanno un supporto per vetrini che rende difficile visualizzare le
estremità del vetrino stesso. In questo caso è sufficiente ruotare il vetrino di 180per
agevolarne la visualizzazione.
Stabilità del vetrino finito
I vetrini FISH restano analizzabili per circa 1 mese se conservati al buio a temperatura
ambiente o inferiore.
Raccomandazioni per l'uso
1. La cottura o l’invecchiamento dei vetrini potrebbe ridurre la fluorescenza del segnale.
2. Le condizioni di ibridazione potrebbero essere influenzate negativamente dall’uso di
reagenti diversi da quelli forniti o raccomandati da Cytocell Ltd.
3. Usare un termometro calibrato per misurare la temperatura delle soluzioni, dell’acqua
e degli incubatori, poiché queste temperature sono fondamentali per ottimizzare le
prestazioni del prodotto.
4. Le concentrazioni, il pH e la temperatura del lavaggio sono importanti, in quanto una
stringenza bassa potrebbe causare un legame non specifico della sonda, mentre una
stringenza troppo elevata potrebbe causare un’assenza di segnale.
5. La denaturazione incompleta può causare un’assenza di segnale, mentre anche una
denaturazione eccessiva può causare un legame non specifico.
6. Un eccesso di ibridazione può causare segnali aggiuntivi o imprevisti.
7. Gli utenti sono tenuti a ottimizzare il protocollo a seconda dei loro campioni, prima di
utilizzare il test per finalità diagnostiche.
8. I vetrini devono essere valutati indipendentemente da due analisti.
9. In caso di legami non specifici potrebbero verificarsi delle condizioni non ottimali, che
potrebbero essere erroneamente interpretate come segnali della sonda.
Risultati attesi
1. Le sonde painting per cromosomi acrocentrici contengono materiale del braccio corto.
Tale materiale è condiviso dai cromosomi dei gruppi D e G, per cui in queste regioni si
può osservare un’ibridizzazione crociata.
2. La sonda painting per cromosoma intero per il cromosoma 16 può mostrare una lieve
ibridizzazione crociata con le regioni eterocromatiche del cromosoma Y.
3. La sonda painting per il cromosoma Y contiene le regioni pseudoautosomiali in comune
con il cromosoma X, perciò in queste regioni si può osservare un’ibridizzazione crociata.
4. I cromosomi 1, 5 e 19 hanno sequenze in comune del DNA centromerico, perciò in
queste regioni si possono osservare ibridizzazioni crociate tra questi cromosomi.
5. La sonda painting per cromosoma intero per il cromosoma 1 può mostrare un segnale
più luminoso in 1p36.
6. Le sonde painting per cromosoma intero non coprono i blocchi eterocromatici nei
cromosomi 1, 9 e 16.

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Limitazioni
La creazione dei report e l’interpretazione dei risultati FISH devono essere coerenti con gli
standard professionali procedurali e devono prendere in considerazione anche altri dati
clinici e diagnostici. Questo kit è pensato come aggiuntivo rispetto ad altri test diagnostici di
laboratorio; l’azione terapeutica non deve essere avviata sulla sola base dei risultati FISH.
Il mancato rispetto del protocollo può influire sulle prestazioni e generare risultati falsi positivi
o falsi negativi.
Questo kit non è stato convalidato per finalità diverse da quelle dichiarate nella sezione
sull’uso previsto.
Informazioni aggiuntive
Per informazioni aggiuntive sul prodotto contattare il Dipartimento di Assistenza Tecnica
Cytocell.
T: [phone]
E: [email protected]
W: www.cytocell.com
DEUTSCH
Die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, mit der DNA-Sequenzen auf
Metaphase-Chromosomen oder Interphase-Kernen in fixierten zytogenetischen Proben
nachgewiesen werden können. Dabei werden DNA-Sonden verwendet, die an ganze
Chromosomen oder einzelne, einmalige Sequenzen hybridisieren. Kürzliche Entwicklungen
haben gezeigt, dass diese nützliche Technik nun auch als essentielles diagnostisches
Werkzeug für pränatale, hämatologische und pathologische Chromosomenanalysen
eingesetzt werden kann. Nachdem die zu untersuchende DNA fixiert und denaturiert wurde,
kann die Fluoreszenz markierte, einzelsträngige Sonde daran binden. Nach der
Hybridisierung werden nicht gebundene sowie unspezifisch gebundene DNA-Sonden durch
eine Reihe von Waschvorgängen entfernt und die DNA zur Visualisierung gegengefärbt.
Unter dem Fluoreszenzmikroskop wird dann die hybridisierte Sonde am Zielmaterial
erkennbar.
Sondeninformation
Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™von Cytocell kombiniert den Nutzen eines
Multisondengeräts mit 8 Quadraten und der Ganzchromosomen-Färbungssonde (in 3
unterschiedlichen Farben markiert), damit alle 24 Chromosomen auf einem einzigen Träger
identifiziert werden können. Das OctoChrome™Gerät ermöglicht die gleichzeitige Analyse
des gesamten Genoms auf einem Träger in einer Hybridisierung.
Sondeninformation
Jedes Quadrat des OctoChrome™Geräts enthält Ganzchromosomen-Färbungssonden für
drei unterschiedliche Chromosomen in drei verschiedenen Farbfluorophoren, rot, grün und
blau (Texas Rot-, FITC- beziehungsweise Aqua/DEAC-Spektren), die simultan mit einem
DAPI/FITC/Texas Rot-Dreifachfilter oder spezifischen Einzelfiltern sichtbar sind.
Die Anordnung von Chromosomenkombinationen in dem OctoChrome™Gerät wurde
entwickelt, um die Identifizierung nicht-statistischer Chromosomenumlagerungen zu
erleichtern, die sich in den häufigsten Leukämieformen finden (Abbildung 1).
Das OctoChrome™ ist für FISH an Metaphasen-Chromosomen aus fixierten kultivierten
peripheren Blutzellen vorgesehen.
Abbildung 1. Standort der Sonden auf demChromoprobe Multiprobe®OctoChrome™.
Kitkomponenten
Jedes Kit enthält die folgenden Reagenzien, die für 2 (PMP 802), 5 (PMP 804) oder 10
(PMP 803) Patientenproben ausreichen:
1. 2, 5 oder 10 Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™ die mit direkt markierten
Painting- Sonden beschichtet sind.
Menge der roten Färbungssonde: 2,5-5ng pro Quadrat
Menge der grünen Färbungssonde: 7,5-12,5ng pro Quadrat
Menge der blauen Färbungssonde: 15-25ng pro Quadrat
2. 4, 7 oder 12 Glasobjektträger, die mit einem speziellen Templat bedruckt sind
3. 500µl Hybridisierungslösung (Formamid, Dextransulfat, SSC)
4. 1 Cytocell Oberflächenthermometer für Objektträger
5. 1 Cytocell Chromoprobe Multiprobe®Hybridisierungskammer
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Für In-vitro-Diagnostik. Nur zur professionellen Verwendung.
2. Beim Umgang mit der Hybridisierungslösung, DNA-Sonden und DAPI-Kontrastfärbung
sind Handschuhe zu tragen.
3. Die Hybridisierungslösung enthält Formamid, das zu den Teratogenen gehört; Dampf
nicht einatmen und Hautkontakt vermeiden. Tragen Sie Handschuhe und einen
Laborkittel und verwenden Sie die Lösung in der Nähe eines Laborabzugschrankes.
Bei der Entsorgung mit viel Wasser nachspülen.
4. DAPI ist ein potentielles Karzinogen. Es ist mit Vorsicht zu handhaben. Tragen Sie
Handschuhe und einen Laborkittel. Bei der Entsorgung mit viel Wasser nachspülen.
5. Alle gefährlichen Materialien sind in Übereinstimmung mit den Richtlinien Ihrer
Einrichtung zur Entsorgung von gefährlichen Abfällen zu entsorgen.
6. Anwender müssen optisch zwischen rot, grün und blau unterscheiden können.
7. Eine mangelnde Einhaltung des Protokolls kann die Leistung beeinträchtigen und zu
falsch positiven/negativen Ergebnissen führen.
Lagerung und Behandlung
Das Chromoprobe Multiprobe®Kit wird bis zum Ablauf des auf dem Kitetikett angegebenen
Haltbarkeitsdatums bei 2-8ºC gelagert. Nicht einfrieren.
Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Ausrüstung und Materialien
1. 500µl Gegenfärbung (DAPI Antifade (ES: 0,125µg/ml DAPI (4,6-Diamidino-2-phenyl-
indol))).
2. Heizplatte (mit stabiler Heizplatte und genauer Temperaturregelung bis 80ºC).
3. Mikropipetten mit variablem Volumen von 1 µl –200µl.
4. Wasserbad mit genauer Temperaturkontrolle bei 72ºC.
5. Mikro-Zentrifugenröhrchen (0,5ml).
6. Fluoreszenzmikroskop (siehe auch “Empfehlungen zum Fluoreszenzmikroskop”).
7. Coplin-Färbetrog aus Kunststoff oder Glas.
8. Pinzette.
9. Für Fluoreszenzobjektive geeignetes Immersionsöl.
10. Tischzentrifuge.
11. Fluoreszenztaugliche Glasdeckplättchen (24 x 50mm)
12. Timer.
13. Wasserbad mit 37ºC ohne Rührer.
Empfehlungen zum Fluoreszenzmikroskop
Verwenden Sie eine 100-Watt-Quecksilberdampflampe und die Objektive Plan-Apochromat
x63 oder x100 für eine optimale Visualisierung. Verwenden Sie einen DAPI/FITC/Texas Red
Dreifach-Bandpassfilter für eine optimale gleichzeitige Visualisierung der grünen und roten
Fluorophore und DAPI. Das Aqua-Fluorophor weist eine Spezifität für das Aqua und DEAC
Spektrum auf (einfacher Aqua oder DEAC Bandpassfilter wird benötigt).
Das Fluoreszenzmikroskop ist vor der Verwendung zu überprüfen, um sicherzustellen, dass
es korrekt funktioniert. Es ist ein Immersionsöl zu verwenden, das für Fluoreszenzmikroskopie
geeignet ist und für geringe Autofluoreszenz formuliert wurde. Eine Vermischung von DAPI
Antifade mit Mikroskop-Immersionsöl ist zu vermeiden, da dies die Signale verschleiern kann.
Die Herstellerempfehlungen bezüglich der Lebensdauer der Lampe und dem Alter der Filter
sind zu befolgen.
Probenvorbereitung
Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™ist für die Verwendung mit kultivierten peripheren
Blutzellen, die in Carnoy’s Fixativ fixiert sind, ausgelegt und sollte nach den Leitlinien des
Labors oder Instituts vorbereitet werden.
Präparieren Sie die luftgetrocknete Proben auf Cytocell Chromoprobe Multiprobe®
Templat-Objektträgern gemäß dem folgenden Cytocell Protokoll. Wärmebehandlung oder
Reifung der Objektträger ist nicht empfehlenswert, da dies zu einer verringerten Signal-
fluoreszenz führen kann.
Chromoprobe Multiprobe®Protokoll
Bitte beachten: Die mit dem Chromoprobe Multiprobe®Gerät verwendeten Sonden sind
direkt mit Fluorophoren markiert und somit lichtempfindlich. Bitte stellen Sie sicher, dass die
Sonde nur in begrenztem Umfang der Strahlung von Laborlampen ausgesetzt ist (es ist
nicht notwendig, im Dunklen zu arbeiten).
1. Vorbereitung des Objektträgers
a) Einen Templat-Objektträger reinigen. Den Templat-Objektträger 2 min lang in 100%
Methanol eintauchen und mit einem sauberen, weichen Tissuetuch trockenpolieren.
b) Korrekten Mitoseindex bestimmen. Der Nachweis von Chromosomenabnormalitäten
ist nur dann möglich, wenn die vorgesehene Probe einen ausreichend hohen
Mitoseindex aufweist. Zur Überprüfung der Dichte der Probe mithilfe einer Mikropipette
(z. B. Gilson P10 oder P20) 4µl der Zellsuspension auf einen der Bereiche des freien
Templat-Objektträgers pipettieren und an der Luft trocknen lassen. Das kleine
Volumen bedeutet, dass der Objektträger leicht mit der Pipettenspitze berührt werden
sollte, um die Suspension zu transferieren. Mittels Phasenkontrastmikroskopie unter-
suchen. Wenn die Zelldichte zu hoch ist, die Suspension mit frischem Fixativ
verdünnen. Wenn der Mitoseindex zu niedrig ist, die fixierte Zellsuspension mit 160xg
10 min lang zentrifugieren. Das Volumen des Überstands notieren, diesen abgießen
und das Zellpellet in einem kleineren Volumen an frischem Fixativ erneut
suspendieren. Nach Änderung der Zellprobendichte 4µl der konzentrierten Probe auf
ein weiteres Quadrat des Objektträgers tüpfeln und erneut durch
Phasenkontrastmikroskopie untersuchen.
Bitte beachten: Für das Protokoll ist ein Mindestvolumen von 50µl erforderlich.
c) Qualitätskontrolle der Proben. Proben müssen auf Zytoplasma untersucht werden,
da dies das In-situ-Protokoll stört. Wenn die Chromosomen bei der Untersuchung
mittels Phasenkontrastmikroskopie von einem granulösen Material eingeschlossen
zu sein scheinen, können keine exakten Ergebnisse erzielt werden. Eine Methode
zur Reduktion des Zytoplasmas besteht darin, 4µl der Probe auf den Templat-
Objektträger zu tüpfeln und das Fixativ bei der Ausbreitung zu beobachten: Das
Fixativ breitet sich unter normalen Umständen maximal aus, weicht zurück und
verdampft dann. Wir haben festgestellt, dass die Aufreinigung von Zytoplasma
dann am erfolgreichsten ist, wenn in dem Augenblick, in dem das sich ausbreitende
Fixativ seine maximal Ausdehnung erreicht hat, ein frischer Tropfen Fixativ auf den
Flecken fallen gelassen wird. Den Tropfen Fixativ verdampfen lassen und den
Flecken neu untersuchen.
d) Tüpfeln des Objektträgers. 4µl Zellsuspension in einer Sequenz von alternierenden
Quadraten wie anschließend gezeigt auf alle 8 Bereiche des Templat-Objektträgers
pipettieren. Dies verhindert, dass sich ausbreitende Proben gegenseitig stören.
e) Nachdem dem Trocknen der ersten Gruppe von Tropfen an Luft 4µl in derselben
Weise auf die restlichen Quadrate tüpfeln. Nach dem Trocknen des Objektträgers
zeigt die Untersuchung des Objektträgers unter Phasenkontrast, ob Quadrate
ausgelassen wurden. Wenn Quadrate nicht getüpfelt wurden oder zu wenig Zellen
aufweisen, diese Quadrate einfach erneut tüpfeln. Das Präparieren eines neuen
Objektträgers ist nicht erforderlich. Wenn ein Quadrat bei der Untersuchung des
Objektträgers zu wenige Zellen/Metaphasen aufweist, können 1 oder mehrere
Tropfen Suspension zugefügt werden, um die Zelldichte zu erhöhen.
Bitte beachten: Wenn die Metaphasen zu stark ausgebreitet erscheinen, wird ein neuer
Templat-Objektträger gründlich in Methanol gereinigt und erneut getüpfelt, wobei jeder
Fleck trocknen muss, ehe der nächste aufgetüpfelt wird.
2. Vorbereitung von Chromoprobe Multiprobe®Gerät und Templat-
Objektträger
a) Kontrollieren, dass sich die Chromoprobe Multiprobe®Hybridisierungskammer im
37ºC warmen Wasserbad befindet. Kammer auf 37ºC (+/- 1ºC) erwärmen lassen.
Dies kann bis zu einer Stunde dauern, wenn das Wasserbad kalt eingeschaltet
wird.
b) Hybridisierungslösung durch wiederholtes Pipettieren mischen, und pro Gerät eine
25µl Aliquote auf 37ºC erwärmen. Auch jedes Gerät vorwärmen, indem es mit der
Etikettenseite nach unten auf eine 37ºC warme Heizplatte gelegt wird. Die
erhabenen Oberflächen des Geräts nicht berühren.
c) Templat-Objektträger, die fixierte Proben enthalten, 2 min bei Raumtemperatur
(RT) ohne Schütteln in 2xSSC eintauchen.

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d) Während das Gerät noch 37ºC warm ist, die Templat-Objektträger, welche fixierte
Proben enthalten, mithilfe einer Ethanolreihe (jeweils 2 min in 70%, 85% und 100%)
bei RT entwässern, an der Luft trocknen lassen und zum Aufwärmen auf eine 37ºC
warme Heizplatte legen.
e) 2µl vorgewärmte Hybridisierungslösung mithilfe einer P10 Mikropipette auf jeden
der 8 Bereiche des vorgewärmten Geräts geben, während es auf der 37ºC warmen
Heizplatte bleibt,
3. Positionierung des Templat-Objektträgers über dem Gerät
a) Templat-Objektträger über dem Gerät vorsichtig umdrehen, so dass sich die
Nummer 1, die nun nach unten weist, über dem oberen rechten Bereich des Geräts
befindet Um Quadrat 1 leichter finden zu können (Chromosomen 3, 15 & 17 seine
Position auf dem Gerät mit einem orangefarbenen Punkt markiert
b) Kontrollieren, dass der Templat-Objektträger sorgfältig an den entsprechenden
Bereichen des Geräts ausgerichtet ist. Objektträger vorsichtig über dem Gerät
absenken, damit die Tropfen der Hybridisierungslösung Kontakt mit dem Ob-
jektträger erhalten. Sanften gleichmäßigen Druck ausüben, damit sichergestellt ist,
dass sich die Hybridisierungslösung zu den Rändern jedes der erhabenen Bereiche
auf dem Gerät ausbreitet.
c) Objektträger vorsichtig anheben, dazu das gefrostete Ende des Glasobjektträgers
halten und den Träger umdrehen, so dass sich der Templat-Objektträger unter dem
Gerät befindet. Kontrollieren, dass der Templat-Objektträger nicht durch das Gerät
verschmiert wird, da dies zu Kreuzverunreinigung der Sonden führen kann.
d) 10 min lang bei 37ºC (+/- 1ºC) (Heizplatte oder Inkubator) stehen lassen.
4. Anweisungen zur Verwendung des Cytocell Oberflächenthermometers für
Objektträger
a) Vor Beginn der Denaturierung mithilfe des Cytocell Oberflächenthermometers für
Objektträger überprüfen, ob die Heizplatte 75ºC warm ist.
b) Korrekte Anwendung des Thermometers: Thermometer auf die Oberfläche der
Heizplatte legen und warten, bis die verschiedenen Segmente ihre Farbe nicht
mehr ändern. Die tatsächliche Temperatur wird durch eine tiefblaue Farbe
angezeigt.
Bitte beachten:
c) Wenn die Segmente körnig aussehen und die Farben nicht länger einheitlich und
regelmäßig erscheinen, ist das Thermometer verbraucht und muss entsorgt
werden. Die Lebensdauer jedes Thermometers sollte jedoch für ein Kit mit 10
Geräten ohne Weiteres ausreichen.
d) Das Thermometer ist ein Flüssigkristallgerät. Obgleich es wiederverwendbar ist,
muss es achtsam behandelt werden, um eine angemessene Lebensdauer
sicherzustellen. Das Thermometer darf nur zur Prüfung der Temperatur einer Heiz-
platte verwendet werden. Es darf nicht eingesetzt werden, um die Leistung der
Heizplatte über eine längere Zeit zu überwachen.
5. Denaturierung
Bitte beachten: Für dieses Verfahren darf die Festbett-Heizplatte NICHT durch
den Heizblock eines PCR–Thermocyclers ersetzt werden.
a) Die sandwichförmige Objektträger/Gerät-Anordnung auf die Heizplatte transferie-
ren, wobei besonders darauf geachtet werden muss, sie waagerecht zu halten.
Kontrollieren, dass der Probenobjektträger ausreichend Kontakt mit der Heizplatte
hat.
b) Auf der Heizplatte bei 75ºC (+/- 1ºC) 5 min lang denaturieren.
6. Hybridisierung
Die sandwichförmige Objektträger/Gerät-Anordnung in die vorgewärmte Chromo-
probe Multiprobe®Hybridisierungskammer legen, den Deckel wieder auflegen und
die Kammer im 37ºC (+/- 1ºC) warmen Wasserbad mit (ohne Rühren) über Nacht
schweben lassen.
Bitte beachten:
a) Deckel auf der Hybridisierungskammer nicht versiegeln.
b) Keinen Deckel auf das Wasserbad legen.
c) Nicht in einem Inkubator hybridisieren.
d) Bitte sicherstellen, dass die Hybridisierungskammer vollständig trocken ist (d.
h. weder Wasser noch feuchtes Gewebe im Inneren der Kammer ist).
Die Feuchtigkeit in der Kammer ist für die optimale Hybridisierung sehr wich-
tig. Das korrekte Niveau mithilfe der obigen Schritte aufrechterhalten.
7. Stringente Wäschen nach der Hybridisierung
Bitte beachten: Nicht mehr als zwei Objektträger gleichzeitig während der
stringenten Wäschen verarbeiten.
a) Gerät vorsichtig von dem Objektträger entfernen.
b) Objektträger 2 min lang ohne Rühren in 0,4xSSC (pH 7,0) eintauchen.
c) Objektträger abtropfen lassen und 30 Sekunden lang ohne Durchmischen in
2xSSC, 0,05% Tween-20 bei RT (pH 7,0) eintauchen.
8. Aufziehen und Visualisierung der Ergebnisse
a) Objektträger abtropfen lassen und an jedem Ende des Objektträgers 20µl DAPI
Antifade aufbringen.
b) Mit einem Deckglas (24 x 50mm) abdecken, die Luftblasen entfernen und die Farbe
10 min lang im Dunkeln entwickeln lassen.
c) Unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachten.
Bitte beachten: Einige Mikroskoptypen haben Objektträgerhalter, die es erschweren,
die äußersten Enden des Objektträgers zu betrachten. Falls dies vorkommt, einfach den
Objektträger um 180º drehen, um seine Betrachtung zu erleichtern.
Stabilität der fertigen Objektträger
Objektträger mit FISH-Proben können bis zu einem Monat lang analysiert werden, wenn sie
im Dunkeln bei oder unter Raumtemperatur gelagert werden.
Empfehlungen zur Durchführung
1. Das Backen oder Altern der Objektträger kann das Fluoreszenzsignal verringern.
2. Die Hybridisierungskonditionen können durch die Verwendung von anderen als den von
Cytocell Ltd. zur Verfügung gestellten oder empfohlenen Reagenzien nachteilig
beeinflusst werden.
3. Es wird dringend empfohlen, zur Temperaturmessung von Lösungen, Wasserbädern
und Inkubatoren ein geeichtes Thermometer zu verwenden, da diese Temperaturen für
die optimale Leistung des Produkts ausschlaggebend sind.
4. Die Konzentration der Waschlösung, pH-Wert und Temperaturen sind besonders
wichtig, da eine niedrige Stringenz zu einer unspezifischen Bindung der Probe und eine
zu hohe Stringenz zu einem fehlenden Signal führen kann.
5. Eine unvollständige Denaturierung kann zu einem fehlenden Signal und eine
Überdenaturierung ebenfalls zu einer unspezifischen Bindung führen.
6. Eine Überhybridisierung kann zu zusätzlichen oder unerwarteten Signalen führen.
7. Benutzer sollten das Protokoll für ihre eigenen Proben optimieren, bevor der Test für
diagnostische Zwecke verwendet wird.
8. Die Objektträger sind von zwei Analysten unabhängig voneinander zu bewerten.
9. Suboptimale Konditionen können zu einer unspezifischen Bindung führen, die als
Probensignal fehlinterpretiert werden kann.
Zu erwartende Ergebnisse
1. Die akrozentrischen Chromosome-Painting-Sonden enthalten Kurzarmmaterial. Dies
wird von Chromosomen der D & G-Gruppe gemeinsam genutzt, so dass in diesen
Regionen Kreuzhybridisierung beobachtet werden kann.
2. Die Whole Chromosome Painting-Sonde für Chromosom 16 kann schwache Kreuzhybri-
disierung mit den heterochromatischen Regionen von Chromosom Y zeigen.
3. Die Painting-Sonde für Chromosom Y enthält die pseudoautosomalen Regionen, die mit
dem X-Chromosom identisch sind. Daher kann in diesen Regionen Kreuzhybridisierung
beobachtet werden.
4. Chromosomen 1, 5 und 15 haben gemeinsame zentromere DNA-Sequenzen. Daher
können zwischen diesen Chromosomen Kreuzhybridisierungen in diesen Regionen
beobachtet werden.
5. Die Whole Chromosome Painting-Sonde für Chromosom 1 kann bei 1p36 ein helleres
Signal zeigen.
6. Whole Chromosome Painting-Sonden deckendie heterochromatischen Blöcke der Chro-
mosomen 1, 9 und 16 nicht ab.
Einschränkungen
Die Angabe und Auswertung der FISH-Ergebnisse muss konsistent anhand von
professionellen Laborstandards erfolgen und muss andere klinische und diagnostische
Informationen berücksichtigen. Dieses Set ist als Ergänzung zu anderen diagnostischen
Labortests zu verstehen und therapeutische Maßnahmen sollten nicht allein auf Grundlage
der FISH-Ergebnisse eingeleitet werden.
Eine mangelnde Einhaltung des Protokolls kann die Leistung beeinträchtigen und zu falsch
positiven/negativen Ergebnissen führen.
Dieses Set wurde nicht für andere Zwecke als dem angegebenen Verwendungszweck
geprüft.
Weitere Informationen:
Weitere Produktinformationen erhalten Sie vom Technischen Kundendienst von Cytocell.
T: [phone]
E: [email protected]
W: www.cytocell.com
ESPAÑOL
La hibridación in situ fluorescente (FISH) es una técnica que permite detectar secuencias de
ADN en cromosomas metafásicos o núcleos interfásicos en muestras citogenéticas y fijadas.
En la técnica se utiliza una sonda de ADN que hibrida los cromosomas completos o las
secuencias únicas simples y es un complemento útil para la citogenética clásica. Recientes
estudios indican que esta es una técnica que puede aplicarse como herramienta esencial de
diagnóstico prenatal, hematológico y patológico. Después de la fijación, el ADN diana se trata
con calor para desnaturalizar el ADN bicatenario haciendo que resulte monocatenario. El
ADN diana queda entonces disponible para hibridarlo con una sonda de ADN igualmente
desnaturalizado, monocatenario marcado con fluorescencia que tiene una secuencia
complementaria. Después de la hibridación la sonda de ADN no específicamente hibridada
y no hibridada se elimina y se aplica un contraste al ADN para su visualización. El uso de un
microscopio de fluorescencia permite la visualización de la sonda hibridada en el material
utilizado.
Información sobre las sondas
Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™de Cytocell combina la utilidad de un dispositivo
Multiprobe de 8 cuadrados y la sonda de pintado del cromosoma completo (marcada en 2
colores diferentes), para poder identificar los 24 cromosomas en un único porta. El dispositivo
OctoChrome™permite analizar simultáneamente todo el genoma en un porta en una
hibridación.
Especificaciones de las sondas
Cada cuadrado del dispositivo OctoChrome™lleva las sondas de pintado de todo el
cromosoma para 3 cromosomas diferentes en 3 fluoróforos de diferente color, a saber, rojo,
verde y azul (espectros de Rojo de Texas, FITC y Aqua/DEAC, respectivamente), que son
visibles simultáneamente con un filtro triple de DAPI/FITC/Rojo de Texas o filtros sencillos
específicos.
La organización de las combinaciones cromosómicas en el dispositivo OctoChrome™facilita
la identificación de las reorganizaciones cromosómicas no aleatorias observadas en la
mayoría de las leucemias comunes (Figura 1).
OctoChrome™ está previsto para FISH en cromosomas en metafase de células sanguíneas
periféricas cultivadas y fijadas.
Figura 1. Ubicación de las sondas en la Multiprobe Chromoprobe®OctoChrome™.
1. Cada kit contiene los siguientes reactivos, suficiente para 2 (PMP 802), 5 (PMP 804) o
10 (PMP 803) muestras de pacientes:
2. 2, 5 o 10 aparatos Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™recubiertos con sondas
marcadas directamente.
Cantidad de la sonda de pintado roja: 2,5-5ng por cuadrado
Cantidad de la sonda de pintado verde: 7,5-12,5ng por cuadrado
Cantidad de la sonda de pintado azul: 15-25ng por cuadrado
3. 4, 7 o 12 portas de vidrio impresos con una rejilla especial
4. 500µl de solución de hibridación (formamida, sulfato de dextrano, SSC)
5. 1 termómetro para la superficie de los portas Cytocell
6. 1 cámara de hibridación del Chromoprobe Multiprobe®de Cytocell
Advertencias y precauciones
1. Para diagnóstico in vitro. Solo para uso profesional.
2. Utilice guantes para al manipular la solución de hibridación, las sondas de ADN y la
contratinción DAPI.
3. La solución de hibridación contiene formamida, que es un teratógeno; no inhale el vapor
ni permita que entre en contacto con la piel. Utilice guantes, bata de laboratorio y
manipule en una campana extractora de humos. Para eliminarla, aclare con abundante
agua.

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4. La contratinción DAPI puede producir cáncer. Manipúlela con cuidado; utilice guantes y
bata de laboratorio. Para eliminarla, aclare con abundante agua.
5. Deseche todos los materiales peligrosos conforme a las directrices de su institución
respecto a la eliminación de residuos peligrosos.
6. Los operadores deben ser capaces de diferenciar visualmente los colores rojo, azul y
verde.
7. No seguir el protocolo puede influir en el rendimiento y causar resultados falsos
positivos/negativos.
Almacenamiento y manejo
El kit Chromoprobe Multiprobe®debe almacenarse a 2-8ºC hasta la fecha de caducidad que
se indica en el envase. No congelar.
Equipos y material necesario pero no incluido
1. 500µl de contratinción (DAPI antifade (ES: 0,125µg/ml de DAPI (4,6-diamidino-2-
fenilindol))).
2. Placa caliente (con una placa sólida y un control de temperatura preciso hasta 80ºC).
3. Micropipetas de volumen variable (rango 1µl - 200µl).
4. Baño de agua con control preciso de temperatura a 72ºC.
5. Tubos de microcentrifugado (0.5ml).
6. Microscopio de fluorescencia (lea la sección Recomendaciones para el microscopio de
fluorescencia).
7. Recipientes de cristal y de plástico.
8. Pinzas.
9. Microscopio de fluorescencia con objetivo de inmersión en aceite.
10. Centrífuga de banco.
11. Cubre de cristal para fluorescencia (24 x 50mm).
12. Cronómetro.
13. Baño maría a 37ºC sin agitador.
Recomendaciones para el microscopio de fluorescencia
Utilice una lámpara de mercurio de 100 Watt y objetivos apocromáticos planos x63 o x100
para una visualización óptima. Utilice un filtro triple paso banda DAPI/FITC/Texas Red para
visualizar los fluoróforos rojos y verdes y DAPI de manera óptima. El fluoróforo aqua presenta
especificidad por el espectro Aqua y DEAC (es necesario un filtro DEAC o Aqua paso banda).
Compruebe el microscopio de fluorescencia antes de usarlo para asegurarse de que funciona
correctamente. Utilice un aceite de inmersión que sea adecuado para el microscopio de
fluorescencia y esté formulado para una baja autofluorescencia. Evite mezclar DAPI Antifade
con aceite de inmersión para microscopio, ya que esto impediría una visualización precisa de
los resultados. Siga las recomendaciones de los fabricantes respecto a la vida útil de la
lámpara y la edad de los filtros.
Preparación de la muestra
El Chromoprobe Multiprobe®OctoChrome™está diseñado para trabajar con células de
sangre periférica fijadas con la solución de fijación de Carnoy que debe prepararse según las
instrucciones del laboratorio o la institución.
Prepare las muestras secadas al aire en los portas con rejilla Chromoprobe Multiprobe®de
Cytocell según el protocolo de Cytocell que se incluye a continuación. No se recomienda
calentar ni madurar los portas de otro modo ya que puede reducir la fluorescencia dela señal.
Protocolo para Chromoprobe Multiprobe®
Observación: Las sondas que se emplean en el aparato Chromoprobe Multiprobe®están
marcadas directamente con fluorocromos sensibles a la luz. Asegúrese de que las sondas
están expuestas a las luces del laboratorio durante el mínimo tiempo posible (no es necesario
trabajar sin luz).
1. Preparación de los portas
a. Limpieza de un porta con rejilla. Sumerja el porta con rejilla durante 2 minutos en metanol
100% y seque y abrillante con un paño suave.
b. Determinación del índice mitótico correcto. Es importante que la muestra que vaya a
emplear tenga un índice mitótico lo suficientemente alto para poder detectar anomalías
en los cromosomas. Para comprobar la densidad de la muestra, pipetee 4µl de la
suspensión celular con ayuda de una micropipeta (por ejemplo una Gilson P10 o P20)
en una de las áreas libres del porta con rejilla y déjelos secar al aire. Como el volumen
que se usa es muy pequeño, normalmente debe tocar suavemente el porta con la punta
de la pipeta para atransferirla suspensión. Examine el porta al microscopio de contraste
de fases. Si la densidad celular es demasiado alta, diluya la suspensión con fijador
preparado reciente. Si el índice mitótico es demasiado bajo, centrifugue la suspensión
celular a 160 x g durante 10 minutos. Anote el volumen del sobrenadante, descártelo y
resuspenda el sedimento de células en un volumen menor de fijador reciente. Si se ha
alterado la densidad de la muestra de células, siembre 4µl de la muestra concentrada
sobre otra casilla de prueba del porta y vuelva a examinar al microscopio de contraste
de fases.
Observación: El volumen mínimo necesario para el protocolo es de 50µl.
c. Control de calidad de las muestras. Las muestras deben examinarse para determinar la
presencia de citoplasma, ya que este interfiere con el protocolo in situ. Si los
cromosomas parecen estar incluidos en un material granuloso cuando se examinan al
microscopio de contraste de fases, los resultados se verán afectados. Un método para
reducir el citoplasma es sembrar 4µl de la muestra sobre el porta con rejilla y observar
cómo se extiende el fijador: en situación normal, el fijador se extenderá al máximo,
retrocederá y después se evaporará. Para limpiar el citoplasma, se ha comprobado que
se consiguen buenos resultados si se deja caer una gota de fijador reciente sobre el
punto en que se ha realizado la siembra cuando la extensión del fijador haya alcanzado
el máximo. Deje evaporar el fijador y vuelva a examinar la siembra.
d. Siembra del porta. Pipetee 4µl de suspensión celular en las 8 zonas del porta con rejilla
según la secuencia de casillas alternas que se muestra a continuación. Esto evitará que
las siembras de células interfieran entre sí.
e. Una vez que se ha secado al aire el primer grupo de gotas, siembre las casillas restantes
con gotas de 4 µl del mismo modo. Cuando se haya secado el porta, examínelo al
microscopio de contraste de fases para comprobar que no falta ninguna de las casillas.
Si falta alguna, o si las casillas tienen pocas células, simplemente vuelva a sembrar esas
casillas: no es necesario utilizar un porta nuevo. Si al examinar el porta, una casilla tiene
un número insuficiente de células/metafases, pueden añadirse más gota(s) de la
suspensión para aumentar la densidad celular.
Observación: Si las metafases aparecen demasiado dispersas, limpie un nuevo porta con
rejilla cuidadosamente en metanol y vuelva a sembrar dejando que cada gota se seque antes
de pasar a la siguiente.
2. Preparación del aparato Chromoprobe Multiprobe®y del porta con rejilla
a) Asegúrese de que la cámara de hibridación del Chromoprobe Multiprobe®está al baño
maría a 37ºC y déjelo llegar al equilibrio a 37ºC (+/- 1ºC). Esto puede llevar hasta una
hora si el baño maría se enciende estando frío.
b) Mezcle la solución de hibridación pipeteando repetidamente y precaliente una alícuota
de 25µl por cada aparato a 37ºC. Precaliente también cada aparato colocándolo sobre
una placa calefactora a 37ºC con el lado de la etiqueta hacia abajo. No toque las
superficies elevadas del aparato.
c) Sumerja los portas con rejilla que contienen las muestras fijadas en 2xSSC durante 2
minutos a temperatura ambiente (TA) sin agitar.
d) Mientras el aparato está todavía a 37ºC, deshidrate los portas con rejilla que contienen
las muestras fijadas en una serie de etanol (2 minutos para cada una de las
concentraciones: 70%, 85% y 100%) a TA, déjelos secar al aire y colóquelos sobre una
placa calefactora a 37ºC para calentarlos.
e) Usando una micropipeta P10, añada 2µl de solución de hibridación precalentada a cada
una de las 8 zonas del aparato precalentado sobre una placa calefactora a 37ºC.
3. Colocación del porta con rejilla sobre el aparato
a) Con cuidado invierta el porta con rejilla sobre el aparato de tal forma que el número 1,
que ahora está boca arriba, quede en la zona superior derecha del aparato (cromosomas
3, 15 & 17), su posición sobre el dispositivo ha sido marcado con un punto naranja.
b) Asegúrese de que el porta con rejilla queda perfectamente alineado con las zonas
correspondientes del aparato. Con cuidado ponga el porta sobre el aparato de forma
que las gotas de la solución de hibridación entren en contacto con el porta. Aplique una
presión suave y homogénea para asegurarse de que la solución de hibridación se
extiende hasta los bordes de cada una de las zonas elevadas del aparato.
c) Levante el porta con cuidado sujetándolo por el extremo esmerilado del porta de vidrio
e inviértalo de forma que el porta con rejilla quede por debajo del aparato. Asegúrese de
que el aparato no gotee sobre el porta con rejilla ya que esto podría provocar
contaminación cruzada de las sondas.
d) Póngalo a 37ºC (+/- 1ºC) (placa calefactora o incubadora) durante 10 minutos.
4. Instrucciones del termómetro de superficie para los portas Cytocell
a) Debe comprobarse que la temperatura de la placa calefactora está a 75ºC con el
termómetro de superficie para los portas Cytocell antes de realizar la desnaturalización.
b) Para usar el termómetro correctamente, colóquelo sobre la superficie de la placa
calefactora y espere hasta que los distintos segmentos dejen de cambiar de color. La
temperatura real se indica con un marcado color aqua.
Observación:
c) Si los segmentos tienen aspecto granuloso y los colores no son uniformes y regulares,
debe desecharse el termómetro ya que se ha gastado. La vida útil de cada termómetro
debería, fácilmente, ser suficiente para un kit de diez aparatos.
d) Este termómetro es un aparato de cristal líquido y, aunquereutlizable, debe tratarse con
cuidado para que la vida útil sea razonable. El termómetro únicamente debe emplearse
para controlar la temperatura de la placa calefactora; no debe usarse para controlar la
función de la placa calefactora durante todo el tiempo.
5. Desnaturalización
Observación: Para este procedimiento NO puede emplearse un bloque calefactor de
ciclado térmico para PCR en lugar de la placa calefactora de lecho sólido.
a) Transfiera el sándwich de porta y aparato a la placa calefactora poniendo especial
atención a que esté horizontal. Asegúrese de que el porta con las muestras hace buen
contacto con la placa calefactora.
b) Desnaturalice sobre la placa calefactora a 75ºC (+/- 1ºC) durante 5 minutos.
6. Hibridación
Introduzca el sándwich de porta y aparato en la cámara de hibridación precalentada del
Chromoprobe Multiprobe®, vuelva a poner la tapa y deje la cámara flotando al baño
maría a 37ºC (+/- 1ºC) (sin agitar) toda la noche.
Observación:
a) No selle la tapa de la cámara de hibridación.
b) No cubra el baño maría.
c) No realice la hibridación en una incubadora.
d) Asegúrese de que la cámara de hibridación está totalmente seca (es decir, que no
queda agua ni materiales húmedos en la cámara).
La humedad del interior de la cámara es vital para una hibridación óptima. Para
conseguir un nivel correcto, debe seguir estos pasos.
7. Lavados estringentes posthibridación
Observación: Evite realizar los lavados estringentes con más de dos portas a la vez.
a) Retire el aparato del porta con cuidado.
b) Sumerja el porta en 0,4xSSC (pH 7,0) a 72ºC (+/- 1ºC) durante 2 minutos sin agitar.
c) Escurra el porta y sumérjalo en 2xSSC, Tween-20 al 0,05% a TA (pH 7,0) durante 30
segundos sin agitar.
8. Montaje y visualización de los resultados
a) Escurra el porta y aplique 20µl de DAPI antifade en cada extremo del porta.
b) Tápelo con un cubre(24 x50mm), quite las burbujas y deje que el color aparezca durante
10 minutos.
c) Obsérvelo al microscopio de fluorescencia.
Observación: Algunos tipos de microscopio tienen pinzas de sujeción para los portas que
pueden dificultar la visualización de los extremos del porta. Si esto sucediera, simplemente
gire el porta 180, lo que ayudará a la observación del porta.
Estabilidad de los portaobjetos terminados
Los portaobjetos de FISH permanecen analizables durante 1 mes si se han almacenado en
la oscuridad y por debajo de la temperatura ambiente.
Recomendaciones de procedimiento
1. La cocción o el envejecimiento de las láminas puede reducir la fluorescencia de la señal
2. Las condiciones de hibridación pueden verse afectadas negativamente por el uso de
reactivos que no hayan sido suministrados o recomendados por Cytocell Ltd.
3. Use un termómetro calibrado para medir la temperatura de las soluciones, de los baños
maría y de las incubadoras, ya que estas temperaturas son cruciales para un
rendimiento óptimo del producto.

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4. Las concentraciones de lavado, pH y temperaturas son importantes, dado que la baja
rigurosidad puede resultar en una fijación no específica de la sonda y una rigurosidad
demasiado alta puede dar lugar a una falta de señal.
5. Una desnaturalización incompleta puede dar lugar una falta de señal y una
sobredesnaturalización puede dar lugar a una fijación no específica.
6. La sobrehibridación puede dar lugar a señales inesperadas o adicionales.
7. Los usuarios deben optimizar los protocolos para sus propias muestras, antes de utilizar
el ensayo para fines de diagnóstico.
8. Las láminas deberán ser marcadas de manera independiente por dos analistas.
9. Las condiciones insuficientes pueden dar lugar a una fijación no específica, que podría
malinterpretarse como una señal de sonda.
Resultados esperados
1. Las sondas de pintado de cromosomas acrocéntricos contienen material de los brazos
cortos. Este es común a los cromosomas de los grupos D y G, de forma que puede
observarse una hibridación cruzada entre estas regiones.
2. La sonda de pintado decromosomas enteros del cromosoma 16 puede mostrar una leve
hibridación cruzada con las regiones heterocromáticas del cromosoma Y.
3. La sonda de pintado del cromosoma Y contiene las regiones pseudoautosómicas que
comparte con el cromosoma X. Por tanto, puede observarse hibridación cruzada en
estas regiones.
4. Los cromosomas 1, 5 y 19 contienen secuencias comunes de ADN centromérico. Por
ello, pueden observarse hibridaciones cruzadas entre estos cromosomas en estas
regiones.
5. La sonda de pintado decromosomas enteros del cromosoma 1 puede mostrar una señal
más fuerte en 1p36.
6. Las sondas de pintado decromosomas enteros no cubren los bloques heterocromáticos
de los cromosomas 1, 9 y 16.
Limitaciones
Los informes y la interpretación de resultados FISH deberán ser consistentes con los
estándares profesionales de práctica y deberán tener en cuenta otra información de
diagnóstico y clínica. El kit está pensado como un adjunto a otros ensayos de laboratorio de
diagnóstico. No deben iniciarse acciones terapéuticas que se basen únicamente en el
resultado FISH.
No seguir el protocolo puede influir en el rendimiento y causar resultados falsos
positivos/negativos.
Este kit no se ha validado para fines diferentes al uso previsto declarado.
Información adicional
Si desea obtener información adicional sobre el producto, póngase en contacto con el
Departamento de soporte técnico de Cytocell.
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E: [email protected]
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REF
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DE: Bestellnummer
FR: Référence du catalogue
IT: Riferimento di Catalogo
ES: Número de catálogo
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DE: In-vitro-Diagnostikum
FR: Dispositif médical de diagnostic in vitro
IT: Dispositivo medico-diagnostico in vitro
ES: Producto sanitario para diagnóstico in vitro
EN: Batch code
DE: Loscode
FR: Code du lot
IT: Codice di lotto
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DE: Gebrauchsanweisung beachten
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IT: Consultare le istruzioni per l'uso
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DE: Hersteller
FR: Fabricant
IT: Fabbricante
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EN: Use by
DE: Verwendbar bis
FR: Utiliser jusqu’au
IT: Utilizzare entro
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DE: Temperaturbegrenzung
FR: Limites de température
IT: Limiti di temperatura
ES: Limitación de temperatura
EN: Sufficient for <n> tests
DE: Ausreichend für
FR: Suffisant pour
IT: Sufficiente per
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DE: Inhalt
FR: Contenu
IT: Contenuto
ES: Contenido
Patents and Trademarks
Chromoprobe, Cytocell and Chromoprobe Multiprobe are registered trademarks
of Cytocell Ltd.
The Chromoprobe principle is covered by international patents WO9314223,
EP0623177. The design of the Multiprobe is a registered design and is also
covered by a Design Patent No. 420,745.
This product contains technology licensed from Life Technologies Corporation
and is available for human diagnostics or life science research use only.
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