Agilent Technologies ZORBAX RRHT Series User manual

COLUMN USER GUIDE
for Agilent Reversed-Phase
Columns
Agilent 反相色谱柱用户指南
Guide d’utilisation des colonnes pour les colonnes à
phase inverse Agilent
Säulenbenutzerhandbuch für Agilent
Umkehrphasensäulen
Manuale utenti per colonne a fase inversa Agilent
Guía de usuario de columna para columnas de fase
reversa Agilent
Agilent 逆相カラム ユーザーガイド
ZORBAX reversed-phase / 反相 / à phase reversa /
Umkehrphase / Fase inversa / Fase inversa / 逆相
HPLC phases / 相/ Phases HPLC / Phasen / Fasi /
Fases /カラム
Poroshell 120/300 / Pursuit / Polaris / HC-C18(2) /
TC-C18(2)

This booklet provides general
information for all ZORBAX, Poroshell,
Pursuit, and Polaris reversed-phase
columns. For additional detailed
information about your specic phase or
family, see:
agilent.com/chem/columnchoices
Getting started
A QC Column Performance Report, including a test
chromatogram, is enclosed with every Agilent column. The
QC test system has been modied from a standard system
to minimize system dead volume, so it may vary from the
system used in your lab. This allows a better evaluation of the
column and assures a more consistent product. A properly
congured LC system will generate similar results to the
chromatogram on your QC Performance Report.
Modern columns are robust and are designed to operate
for long periods under normal chromatographic conditions.
You can maximize column performance by running it within
specications. Always review the specications before
putting in place a nal method.

Using Your Column
Installation
• The direction of ow is marked on the column.
• 1.8 µm columns (ZORBAX RRHT, ZORBAX RRHD) can only
be operated in the direction ow marked on the column.
For removable, zero-dead volume column connections
Agilent recommends the use of the InnityLab Quick Connect
and Quick Turn family. Choices are:
Maximum
System
Pressure Recommended Fitting Part Numbers
Up to 400 bar InnityLab Quick Turn Fitting
(nger-tight)
Fitting: 5067-5966
Up to 800 bar InnityLab Quick Turn Fitting
(with Mounting tool)
Fitting: 5067-5966
Mounting Tool:
5043-0915
Up to 1300 bar InnityLab Quick Connect Fitting Fitting: 5067-5965
For more information and part numbers, please see to the
AgilentInnityLab Fitting Brochure (5991-5164EN).
ENGLISH
InnityLab Quick Connect
assembly, p/n 5067-5961
InnityLab Quick Turn
tting, p/n5067-5966
Learn more at: www.agilent.com/chem/innitylabttings

Column conditioning
Every column is tested before shipment and shipped
in the test eluent. So, for rst use, rinsing with water is
not necessary. If mobile phase additives are used (such
as buffers or ion-pair reagents) it is advisable to do an
intermediate ush with a mobile phase of the correct
composition, but without these additions. Flushing with
10to 20 column volumes should help in transitioning to your
mobile phase. For shorter chain chemistries (C8, Phenyl, CN,
for example), care should be taken to make sure the column
has been properly equilibrated prior to use. This will ensure
reproducibility and help prevent retention time drifting.
Important safety considerations
• All points of connection in liquid chromatographic systems
are potential sources of leaks. Users should be aware of
the toxicity or ammability of their mobile phases.
• Because of the small particle size, dry column packings
are respirable. Columns should only be opened in a well
ventilated area.
• Please adhere to operating pressure limits noted for
each column (see table). Exceeding these limits will
compromise chromatographic performance and could
beunsafe.
Other operating tips
• While generally not harmful to the column, reverse ow
should be avoided except to attempt removal of clogged
frit (see Column care).
• Always use high purity reagents and chromatography
grade solvent to prepare your mobile phase. Degas and
lter all mobile phase prior to use.
• Disassembling a column will degrade column
performance.

• New columns contain a mixture of organic solvents and
water. See your QC Performance Report for the solvent
composition in your column. Initially, care should be taken
not to pass any mobile phase through the column that
may cause a precipitate to form.
• Agilent reversed-phase columns are compatible with water
and all common organic solvents.
• The use of a guard column is recommended to protect
your column and increase its lifetime.
• Columns should not be maintained at elevated pH or
elevated temperature when not in use.
• Avoid use of this column outside of recommended
pHranges for column phase (see next page).
Expect reduced lifetime when operating outside the
recommended pH and temperature ranges.
If you are using Poroshell 120 or ZORBAX RRHT or RRHD columns,
consider using a Fast Guard for UHPLC to protect your analytical
column. See agilent.com/chem/fastguards for more information.
ENGLISH

Column operating parameters: pH and temperature
Note: All silica-based packings have some solubility in pH >6 aqueous
mobile phases. When using silica-based columns at pH >6, best column
lifetime is obtained at lower temperatures (40 °C max) using low buffer
concentrations in the range of 0.01 to 0.02 M. Operating at extreme ends
of pH and temperature ranges will have a signicant impact on column
lifetime.
Phase
Recommended
pH Range
Maximum Operating
Temperature
Poroshell HPH pH 3.0 to 11.0 60 °C
Poroshell 120 SB-C18,
StableBond C18,
ZORBAXRx-C8,
ZORBAX SB-Aq,
ZORBAX SB-Phenyl,
SB-C3, Poroshell 300,
300SB-C3
pH 1.0 to 8.0 90 °C (StableBond C18
and Poroshell 120 SB-C18)
80 °C (Rx-C8 and SB-Aq,
SB-C3 and SB-Phenyl)
70 °C for pH <5.0; 40°C
for pH 5.0 to 8.0 (Poroshell
300 and 300SB-C3)
ZORBAX Eclipse Plus C18
and C8, Eclipse XDB-C8,
XDB-C18, XDB-Phenyl,
Poroshell 120 EC-C18 and
EC-C8, ZORBAX Bonus-RP,
HC-C18(2) and TC-C18(2)
pH 2.0 to 9.0 60 °C
ZORBAX Extend C18 pH 2.0 to 11.5 60 °C (40 °C at high pH)
Poroshell 120 PFP,
Poroshell 120 Phenyl-Hexyl,
ZORBAX ODS,
ZORBAXPhenyl,
ZORBAXEclipse Plus
Phenyl-Hexyl,
ZORBAX XDB-CN,
ZORBAXEclipse PAH,
AllPursuit and Polaris
bonded phases
pH 2.0 to 8.0 60 °C
ZORBAX Eclipse PAH pH 2.0 to 8.0 60 °C at pH <6.0
ZORBAX TMS pH 2.0 to 7.0 60 °C

Maximum operating pressures—columns up to 9.4 mm id
Column type Particle size Pressure limit
Poroshell 120 1.9 µm
2.7 μm, 4 μm
1300 bar (19,500 psi)
600 bar (9000 psi)
Poroshell 300 5 μm 400 bar (6000 psi)
ZORBAX Rapid Resolution 3.5 µm 400 bar (6000 psi)
ZORBAX Rapid Resolution High
Throughput (RRHT)
1.8 μm 600 bar (9000 psi)
ZORBAX Rapid Resolution High
Denition (RRHD)
1.8 μm 1200 bar (17,000 psi)
All ZORBAX, Pursuit, and Polaris
columns, not noted as RRHT or
RRHD, and HC-C18(2), TC-C18(2)
3.0 μm, 3.5 μm,
5 μm
400 bar (6000 psi)
200 bar (3000 psi)
(Metaguards)
Mobile phase selection and operating
temperatures
The bonded stationary phase is nonpolar in nature and is
best used with polar mobile phases such as methanol/water
or acetonitrile/water mixtures. Increasing the amount of
organic component typically reduces the retention time of
the sample.
ENGLISH

Recommended starting gradients
Stationary phase Usage notes
Most reversed-phase
columns
5% methanol or acetonitrile initially and 100%
methanol or acetonitrile as the nal solvent.
ZORBAX Eclipse PAH* 30 or 40% acetonitrile initially, to 100%
acetonitrile as nal solvent. It may be necessary
to cool column to 15 to 20 °C for improved
resolution.
ZORBAX Bonus-RP Lower concentration of organic mobile phase
modier is required for compound elution,
compared to traditional long-chain alkyl
stationary phases.
Large molecule
columns (for example,
Poroshell300 or
ZORBAX300SB
columns)
Separations of polypeptides, proteins, DNA
fragments, etc. often use triuoroacetic or
formic acid modier for pH control and/or as
an ion-pairing additive for desired retention
and selectivity. Organic buffers such as TRIS
are especially useful for intermediate pH
applications.
* Best column lifetime is achieved at <40 °C.

Column care
The inlet frit on columns with a particle size of 2.7 µm or
greater has a nominal porosity of 2 µm. Samples that contain
particulate matter will plug the column inlet frit. ZORBAX
and Fast Guard columns and hardware kits (as required) are
recommended for use with such samples, and are gener-ally
recommended for all column use.
See agilent.com/chem/fastguards for more information
about guard columns.
Cleaning Your Column/Extending Column Life
For columns that can be backushed (Poroshell 120,
ZORBAX columns with particles >1.8 µm and all Pursuit and
Polaris columns), start with a stronger (less polar) solvent.
1. Disconnect column from detector and run wash solvents
into a beaker.
2. Start with your mobile phase without buffer salts
(water/organic). Run at 10 to 20 column volumes through.
3. Next, use 100% organic (methanol or acetonitrile).
4. Check pressure to see if it has returned to normal; if not,
then,
5. Discard column or consider stronger conditions, for
example, 75% acetontrile/25% isopropanol
6. Increase to 100% isopropanol, 100% methylene chloride
or 100% hexane (if you use methylene chloride or hexane,
you will need to ush the column with isopropanol prior to
use and before returning to your reversed-phase mobile
phase).
For columns with particles <1.8 µm, do not backush the
column—replace the column.
ENGLISH

Storage recommendations
Long-term storage of silica-based, bonded phase columns
should be in a pure organic solvent. If the column has
previously been used with a buffered mobile phase, the
buffer should rst be removed by purging the column with
20 to 30 column volumes of a 50:50 mixture of methanol
or acetonitrile and water, followed by 20 to 30 column
volumes of the pure solvent. Before storing, end-ttings
should be tightly capped with end-plugs to prevent packing
from drying out. Columns may be safely stored for short
periods in most mobile phases. To protect equipment, is it
desirable to remove salts from the instrument and column
by purging the column with the same mobile phase without
the buffer (for example using 60:40 ACN/H20 to remove
a 60:40 ACN/0.02M phosphate buffered mobile phase).
Re-equilibration is rapid with the original mobile phase when
using this approach and any danger of corrosion from the
salts is eliminated.

Tips for getting the best chromatographic results
• Optimize your instrument by minimizing tubing lengths
between components, to reduce extra column volume and
band broadening. Use 0.12 mm id red tubing or 0.075 mm
id black tubing for Fast LC/high efciency columns. Learn
about capillary options at agilent.com/chem/lccapillaries
• Ensure the data collection rate is optimized for your
column. Use a higher collection rate for Fast LC columns
(Poroshell 120, RRHT, and RRHD).
• Use sample ltration or other sample prep as appropriate
for your sample. Learn more at:
agilent.com/chem/sampleprep
• Use Agilent certied lamps in your LC instruments for
bestperformance.
ENGLISH

本小册子提供适用于所有 ZORBAX,
Poroshell, Pursuit, 和 Polaris 反相色谱
柱的一般信息。 有关特定固定相或产品系
列的 详细信息，请访问：
agilent.com/chem/columnchoices
入门指南
每个 Agilent 色谱柱都附带一个 QC 色谱柱性能报告，该报告包
含一个测试色谱图。QC 测试系统是在标准系统基础上改装而成
的，它具有相对较低的系统死体积，因此，它与实验室中使用的
系统不同。这样可以更好地评估色谱柱并确保获得更一致的产
品。正确配置的 LC 系统将生成与 QC 性能报告中的色谱图相似
的结果。
现代色谱柱都很耐用，在正常的色谱条件下，可以使用很长时间。
在合适的条件下使用可以最大化色谱柱寿命。在应用方法之前请
务必检阅色谱柱使用条件。

使用色谱柱
安装
• 在色谱柱上标明了流向。
• 只能按色谱柱上标记的流向操作 1.8 µm 色谱柱
(ZORBAX RRHT, ZORBAX RRHD)。
• Agilent 建议对最高耐压为 600 bar 的色谱柱使用聚酮接
头 (5042-8957)，对将在 UHPLC 压力下操作的色谱柱使用
1200 bar 可拆卸接头 (5067-4733)。
Maximum
System
Pressure Recommended Fitting Part Numbers
Up to 400 bar In󽗉nityLab Quick Turn Fitting
(󽗉nger-tight)
Fitting: 5067-5966
Up to 800 bar In󽗉nityLab Quick Turn Fitting
(with Mounting tool)
Fitting: 5067-5966
Mounting Tool:
5043-0915
Up to 1300 bar In󽗉nityLab Quick Connect Fitting Fitting: 5067-5965
For more information and part numbers, please see to the
Agilent In󽗉nityLab Fitting Brochure (5991-5164EN)
中文
InnityLab Quick Connect
assembly, p/n 5067-5961
Quick Turn tting,
p/n5067-5966
Learn more at: www.agilent.com/chem/innitylabttings

色谱柱老化
每个色谱柱在装运之前都经过了测试，并放在测试洗脱液中运
输。因此，在首次使用时，没有必要用水进行冲洗。如果使用流动
相添加剂（如缓冲液或离子对试剂），建议使用含正确成分但不含
这些添加剂的流动相进行中间过渡。使用 10 至 20 个色谱柱体
积进行冲洗将有助于过渡到流动相。对于具有较短的化学链（例
如 C8、苯基、CN）固定相的色谱柱，应小心确保在使用色谱柱之
前对其进行了彻底的平衡。这样可确保重复性，并有助于防止保
留时间漂移。
重要安全注意事项
• 液相色谱系统中的所有连接点都有可能成为泄漏源。用户应
注意流动相的毒性或易燃性。
• 柱填充物在干的情况下属于微小颗粒，因此可能会被吸入呼
吸道。只能在通风良好的区域打开色谱柱。
• 请遵照为每个色谱柱标明的操作压力限制进行操作（参见图
表）。超过这些限制会降低色谱性能，而且很不安全。

其他操作提示
• 虽然反冲一般不会损坏色谱柱，但还是应避免，除非是在尝试
去除柱前筛板堵塞物时（请参见“色谱柱维护”）。
• 始终使用高纯度试剂和色谱级溶剂来准备流动相。在使用之
前对所有流动相进行脱气和过滤。
• 打开色谱柱会降低色谱柱性能。
• 新色谱柱包含有机溶剂和水的混合物。请参见 QC 性能报告，
了解色谱柱中的溶剂成分。开始时，应小心不要让任何可能导
致形成沉淀的流动相通过色谱柱。
• Agilent 反相色谱柱与水和所有常见的有机溶剂兼容
• 建议使用预柱来保护色谱柱并延长其使用寿命。
• 在不使用色谱柱时，不能在高的 pH 或高的温度条件
下保存色谱柱。
• 避免在超出建议的色谱柱相应的 pH 范围的条件下使用此色
谱柱（请参见下一页）。在超出建议的 pH 和温度范围条件下操
作会缩短其使用寿命。
如果您正在使用Poroshell 120 或者ZORBAX RRHT或RRHD色谱
柱，请使用Fast Guard ，访问 agilent.com/chem/fastguards
获取更多信息。
中文

色谱柱操作温度：pH 和温度
键合相 建议的 pH 范围 最高操作温度
Poroshell HPH pH 3.0 至 11.0 60 °C
Poroshell 120 SB-C18,
StableBond C18,
ZORBAX Rx-C8,
ZORBAX SB-Aq,
ZORBAX SB-Phenyl, SB-C3,
Poroshell 300, 300SB-C3
pH 1.0 至 8.0 90 °C (StableBond C18 和
Poroshell 120 SB-C18)
80 °C (Rx-C8 和 SB-Aq,
SB-C3 和 SB-Phenyl)
pH <5.0 时为 70 °C; pH
5.0 至 8.0 时为 40 °C
(Poroshell 300 和 300SB
C3)
ZORBAX Eclipse Plus C18
和 C8, Eclipse XDB-C8,
XDB-C18, XDB-Phenyl,
Poroshell 120 EC-C18 和
EC-C8, ZORBAX Bonus-RP,
HC-C18(2) and TC-C18(2)
pH 2.0 至 9.0 60 °C
ZORBAX Extend C18 pH 2.0 至 11.5 60 °C (pH 较高时为 40 °C)
Poroshell 120 PFP,
Poroshell 120
Phenyl-Hexyl,
ZORBAX ODS,
ZORBAX Phenyl,
ZORBAX Eclipse Plus
Phenyl-Hexyl,
ZORBAX XDB-CN,
ZORBAX Eclipse PAH,
所有 Pursuit 和 Polaris 键
合相
pH 2.0 至 8.0 60 °C
ZORBAX Eclipse PAH pH 2.0 至 8.0 pH <6.0 时为 60 °C
ZORBAX TMS pH 2.0 to 7.0 60 °C
注意：所有硅胶基质填充物在 pH >6 含水流动相中具有一定的可溶性。在
pH->6 的环境下使用硅胶基质色谱柱时，应该使用范围在 0.01 至 0.02 M 的
较低缓冲液浓度，以及较低温度（最高为 40 °C），这样可获得最佳色谱柱使用
寿命。在极端的pH或温度下操作会导致色谱柱 寿命的显著降低。

中文
色谱柱类型 颗粒尺寸 压力限制
Poroshell 120 1.9 µm
2.7 μm, 4 μm
1300 bar (19,500 psi)
600 bar (9000 psi)
Poroshell 300 5 μm 400 bar (6000 psi)
ZORBAX 快速分离 3.5 µm 400 bar (6000 psi)
ZORBAX 快速分离高通量 (RRHT) 1.8 μm 600 bar (9000 psi)
ZORBAX 快速分离高分辨率
(RRHD)
1.8 μm 1200 bar (17,000 psi)
所有 ZORBAX, Pursuit,
和 Polaris, 色谱柱，未记录为
RRHT 或 RRHD，以及 HC-C18(2),
TC-C18(2)
3.0 μm, 3.5 μm,
5 μm
400 bar (6000 psi)
最大操作压力 — 内径最大为 9.4 毫米的色谱柱
建议的梯度初始比例
流动相选择和操作温度
键合固定相本质上是非极性的，最适合与极性流动相结合使用，
如甲醇／水或乙腈／水混合物。增加有机相比例通常会缩短样品
的保留时间。
固定相 用法说明
大多数反相色谱柱 最初为 5% 甲醇或乙腈，100% 甲醇或
乙腈作为最终溶剂。
ZORBAX Eclipse PAH* 最初为 30 或 40% 乙腈，至 100% 乙腈作为最
终溶剂。要提高分离度，可能需要将色谱柱冷却
至 15 至 20 °C。
ZORBAX Bonus-RP 与传统的长链烷基固定相相比，化合物洗脱需要
使用浓度较低的有机流动相改性剂。
大分子色谱柱
（如 Poroshell 300,
ZORBAX 300SB色谱柱）
多肽、蛋白质、DNA 片断等的分离通常使用三
氟醋酸或甲酸改性剂以进行 pH 控制和／或
作为离子对添加剂，以获得所需的保留和选择
性。有机缓冲液（如 TRIS）对于中间 pH 应用特
别有帮助。
*在温度 < 40 °C 时色谱柱达到最佳使用寿命。

色谱柱维护
具有颗粒尺寸为 2.7 µm 或更大的色谱柱，它们的进口筛板的空
隙是 2 µm。样品中包含颗粒物将堵塞色谱柱进口筛板。要使用此
类样品，建议使用 ZORBAX 和 Fast Guard 预柱（如果需要），在使
用所有色谱柱时，通常也建议使用这些预柱。
有关保护色谱柱的详细信息，请访问
agilent.com/chem/fastguards
清洁您的色谱柱/延长色谱柱使用寿命
对于可以进行反冲的色谱柱（Poroshell 120、颗粒尺寸大于
1.8 µm 的 ZORBAX 色谱柱和所有 Pursuit 和 Polaris 色谱柱），
请用强洗脱度，较小极性的溶剂开始清洗。
1. 断开色谱柱与检测器的连接，然后把柱后废液导入烧杯。
2. 从你所使用的流动相开始清洗（但必须去除缓冲盐）。 按 10
到 20 色谱柱体积量注入。
3. 下一步，使用 100% 有机相（甲醇或乙腈）。
4. 检查压力，以查看压力是否返回到正常状态，如果没有返回
到正常状态，则进行以下步骤。
5. 丢弃色谱柱或使用更强的条件，例如 75% 乙腈／25% 异 丙
醇。
6. 提高到 100% 异丙醇、100% 二氯甲烷或 100% 己烷（如果您
使用二氯甲烷或己烷，则需要使用异丙醇冲洗色谱柱，然后
才能使用并返回到反相移动相）。
对于填料颗粒尺寸小于 1.8 µm 的色谱柱，请勿反冲此色谱 柱 而
是更换此色谱柱。

中文
存放建议
硅胶基质键合相色谱柱应在纯有机溶剂中进行长期存放。 如果
色谱柱已使用了含缓冲盐的流动相，应首先使用甲醇或乙腈和水
的 50:50 混合物对色谱柱进行 20 至 30 个色谱柱体积的冲洗，然
后使用纯溶剂进行 20 至 30 个色谱柱体积的 冲洗。在存放之前，
应使用堵头堵住接头，以防止填充物变干。将色谱柱放在大多数
流动相中可安全存放较短时间。为了保护设备，需要使用不含缓
冲液的相同的流动相对色谱柱进行冲洗，以从仪器和色谱柱中去
除盐分（例如，使用 60:40 ACN/H
2
0 去除 60:40 ACN/0.02 M 磷酸
盐缓冲的流动相）。在使用此方法时，可使用原始流动相快速进行
重新平衡， 并消除了被盐分腐蚀的危险。
获得最佳色谱结果的提示
• 尽可能缩短组件之间管线的长度，以减少柱外体积和谱带扩
展，从而优化仪器。对快速 LC/高效色谱柱，请使用内径为 0.12
毫米的红色管线。有关毛细管选件，请访问
agilent.com/chem/lccapillaries
• 确保针对色谱柱优化数据采集速率。对快速 LC 色谱柱
(Poroshell 120, RRHT, RRHD) 使用较高的采集速率。
• 根据样品使用适当的样品过滤或其他样品准备方法。要了解
详细信息，请访问 agilent.com/chem/sampleprep
• 在 LC 检测器中使用 Agilent 认证的紫外灯，
以获得最佳性能。

Ce livret fournit des informations
générales relatives à toutes les colonnes
ZORBAX, Poroshell, Pursuit, et Polaris à
phase inverse.
Pour obtenir des informations
supplémentaires plus détaillées relatives
à votre phase ou à votre famille en
particulier, visitez le site:
agilent.com/chem/columnchoices
Mise en route
Un rapport sur les performances QC des colonnes,
comprenant un chromatogramme-test, accompagne chaque
colonne Agilent. Le système HPLC de test QC a été modié
par rapport à un système standard an de minimiser les
volumes morts dans le système, de sorte qu’il peut être
différent du système utilisé dans votre laboratoire. Cela
permet une meilleure évaluation de la colonne et garantit
une meilleure conformité du produit. Un système LC
correctement conguré génèrera des résultats similaires au
chromatogramme sur votre rapport des performances QC.
Les colonnes modernes sont particulièrement robustes
et sont conçues pour être utilisées sur de longues durées
dans des conditions expérimentales normales. Protez
pleinement des performances de votre colonne en l’utilisant
conformément aux spécications techniques. Prenez
toujours le temps de vérier les spécications techniques
avant de mettre en place une méthode dénitivement.