Beckman Coulter CD103-FITC User manual

B77267–AC
MADEINFrance
IOT est
ConjugatedAntibody
CD103-FITC
B49222100tests;2mL,20µL/test
TABLEOFCONTENTS
English........................................................2
Français(FR).....................................................5
Deutsch(DE).....................................................8
Italiano(IT).....................................................11
Español(ES).....................................................14
PortuguêsPortugal(PT-PT)..............................................17
Dansk(DA).....................................................20
Svenska(SV)....................................................23
Norsk(NO).....................................................26
Ελληνικά(EL)....................................................29
Lietuviškai(LT)....................................................32
Magyar(HU).....................................................35
Polski(PL)......................................................38
Čeština(CZ).....................................................41
Slovenčina(SK)...................................................44
한국어(KO).....................................................47
Русский(RU)....................................................50
eestikeel(ET)....................................................53
Hrvatski(HR).....................................................56
Български(BG)...................................................59
Română(RO)....................................................62
Србија(SR).....................................................65
Latviešu(LV).....................................................68
Українська(UK)...................................................71
APPENDIX.....................................................74
REFERENCES....................................................75
©2019BeckmanCoulter,Inc.Allrightsreserved.

B77267–AC2of76
Specications
SpecicityCD103
Clone2G5
HybridomaNS1xbalb/c
ImmunogenHumanintestinallymphocytes(HML1)
ImmunoglobulinIgG2a
SpeciesMouse
PuricationAfnitychromatography
FluorochromeFluoresceinisothiocyanate(FITC)
MolarratioFITC/Ig:5.0-7.0
λexcitation488nm
EmissionPeak525nm
BufferPBSpH7.2plus2mg/mLBSAand0.1%NaN3
IOT est
ConjugatedAntibody
CD103-FITC
B49222100tests;2mL,20µL/test
Forinvitrodiagnosticuse.
INTENDEDUSE
Thisuorochrome-conjugatedantibodyallowstheidenticationofcellpopulationsexpressingtheCD103antigenpresentinhumanperipheralbloodusing
owcytometry.
PRINCIPLE
Thistestisbasedontheabilityofspecicmonoclonalantibodiestobindtotheantigenicdeterminantsexpressedbyleucocytes.
SpecicstainingoftheleucocytesisperformedbyincubatingthesamplewiththeIOTestreagent.Theredcellsarethenremovedbylysisandtheleucocytes,
whichareunaffectedbythisprocess,areanalyzedbyowcytometry.
Theowcytometermeasureslightdiffusionandtheuorescenceofcells.Itmakespossiblethedelimitationofthepopulationofinterestwithintheelectronic
windowdenedonahistogram,whichcorrelatestheorthogonaldiffusionoflight(SideScatterorSS)andthediffusionofnarrow-anglelight(ForwardScatter
orFS).Otherhistogramscombiningtwoofthedifferentparametersavailableonthecytometercanbeusedassupportsinthegatingstagedependingonthe
applicationchosenbytheuser.
EXAMPLESOFCLINICALAPPLICATIONS
CD103isexpressedinseveralsubsetsoflymphocytesincludingasmallsubsetofperipherallymphocytes(Tregcells),onactivatedandTGF-betastimulated
lymphocytes,onintestinalintraepitheliallymphocytes,laminaproprialymphocytes,epithelialdendriticcells,andlaminapropria-deriveddendriticcells.CD103⁺
dendriticcellsintheintestinalmucosallaminapropriaappeartoplayanimportantroleinmaintainingintestinalimmunehomeostasisinducingtolerogenic
immuneresponsesandimprintingphenotypicchangesonantigen-specicTcells.
DCsexpressingCD103intheintestineinduceFoxp3T-regsfromFoxp3-CD4TcellswithendogenousTGF-βandretinoicacid(1,2).Also,apopulationof
CD8+CD103+TcellshasbeendescribedwitheffectorandTregulatorycellfunctionsparticipatingasefferentintheallograftrejectionandsuppressorof
cytotoxicity/proliferation,respectively(3,4).CD103isincludedinthepaneldistinctivefortheimmunophenotypiccharacterizationofHairycellleukemiathat
includeabnormallybrightCD20+CD22+,CD11c+,CD25+,positiveCD103+,CD123+associatedwithnegativeCD5-,CD10-andCD23-(5,6,7,8).
REAGENTS
Concentration:SeelotspecicCerticateofAnalysisatwww.beckmancoulter.com.
WARNINGANDPRECAUTIONS
1.Donotusethereagentbeyondtheexpirydate.
2.Donotfreeze.
3.Letitcometoroomtemperature(18–25°C)beforeuse.
4.Minimizeexposuretolight.
5.Avoidmicrobialcontaminationofthereagents,orfalseresultsmayoccur.
6.Antibodysolutionscontainingsodiumazide(NaN3)shouldbehandledwithcare.Donottakeinternallyandavoidallcontactwiththeskin,mucosa
andeyes.
Moreover,inanacidmedium,sodiumazidecanformthepotentiallydangeroushydrazoicacid.Ifitneedstobedisposedof,itisrecommendedthat
thereagentbedilutedinalargevolumeofwaterbeforepouringitintothedrainagesystemsoastoavoidtheaccumulationofsodiumazideinmetal
pipesandtopreventtheriskofexplosion.
7.Allbloodsamplesmustbeconsideredaspotentiallyinfectiousandmustbehandledwithcare(inparticular:thewearingofprotectivegloves,gowns
andgoggles).
8.Neverpipetbymouthandavoidallcontactofthesampleswiththeskin,mucosaandeyes.
9.Bloodtubesanddisposablematerialusedforhandlingshouldbedisposedofinadhoccontainersintendedforincineration.
10.Reagentsandwasteshouldbeeliminatedaccordingtolocalrequirements.
GHSHAZARDCLASSIFICATION
Notclassiedashazardous

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SafetyDataSheetisavailableatbeckman.com/techdocs
STORAGEANDSTABILITY
Theconjugatedliquidformsmustbekeptatbetween2and8°Candprotectedfromlight,beforeandafterthevialhasbeenopened.
Stabilityofclosedvial:seeexpirydateonvial.
Stabilityofopenedvial:thereagentisstablefor180days.
SAMPLES
VenousbloodmustbetakenusingsteriletubescontaininganEDTAsaltastheanticoagulant.
Thesamplesshouldbekeptatroomtemperature(18–25°C)andnotshaken.Thesamplesshouldbehomogenizedbygentleagitationpriortotakingthe
testsample.
Thesamplesmustbeanalyzedwithin24hoursofvenipuncture.
EVIDENCEOFDETERIORATION
Anychangeinthephysicalappearanceofthereagentsmayindicatedeteriorationandthereagentshouldnotbeused.
Incaseofpackagingdeteriorationorifdataobtainedshowsomeperformancealteration,pleasecontactyourlocaldistributororusethefollowinge-mail
address:[e-mail]
CONTENTS
Sodiumazidepreservativemayformexplosivecompoundsinmetaldrainlines.SeeNIOSHBulletin:ExplosiveAzideHazard(8/16/76).
Toavoidthepossiblebuild-upofazidecompounds,ushwastepipeswithwaterafterthedisposalofundilutedreagent.Sodiumazidedisposalmustbein
accordancewithappropriatelocalregulations.
MATERIALSNEEDEDBUTNOTSUPPLIEDWITHKIT:
•Samplingtubesandmaterialnecessaryforsampling.
•Automaticpipetteswithdisposabletipsfor20,100and500µL.
•Plastichaemolysistubes.
•Calibrationbeads:Flow-SetProFluorospheres(Ref.A63492)Flow-CheckProFluorospheres(Ref.A63493)
•Redcelllysisreagentwithwashingstageafterlysis.Forexample:VersaLyse(Ref.A09777).
•Leucocytexationreagent.Forexample:IOTest3FixativeSolution(Ref.A07800).
•Isotypiccontrol:FITCIOTestreagent(Ref.A12689)
•Buffer(PBS:0.01Msodiumphosphate;0.145Msodiumchloride;pH7.2).
•Centrifuge.
•Automaticagitator(Vortextype).
•Flowcytometer.
PROCEDURE
ProcedurewithVersaLysereagent
Foreachsampleanalyzed,inadditiontothetesttube,onecontroltubeisrecommendedinwhichthecellsaremixedinthepresenceoftheisotypiccontrol
(Ref.A12689)
1.Add20µLofspecicIOTestconjugatedantibodytoeachtesttube,and20µLoftheisotypiccontroltoeachcontroltube.
2.Add100µLofthetestsampletobothtubes.Vortexthetubesgently.
3.Incubatefor15to20minutesatroomtemperature(18–25°C),protectedfromlight.
4.Thenperformlysisoftheredcells,byfollowingtherecommendationsofthelysisreagentused.
Forexample,ifyouwishtouseVersaLyse(Ref.A09777),refertotheleaetandfollowpreferablytheprocedurecalled“withconcomitantxation”,
whichconsistsinadding1mLofthe“Fix-and-Lyse”mixturepreparedextemporaneously.Vorteximmediatelyforonesecondandincubatefor10
minutesatroomtemperature,protectedfromlight.
5.Centrifugefor5minutesat150xgatroomtemperature.
6.Removethesupernatantbyaspiration.
7.Resuspendthecellpelletusing3mLofPBS.
8.Repeatstep5.
9.Removethesupernatantbyaspirationandresuspendthecellpelletusing:
0.5mLofPBSplus0.1%offormaldehydeifthepreparationsaretobekeptlessthan24hours.(A0.1%formaldehydePBScanbeobtainedbydiluting
12.5µLoftheIOTest3FixativeSolution(Ref.A07800)atits10Xconcentrationin1mLofPBS).
0.5mLofPBSwithoutformaldehyde,ifthepreparationsaretobeanalyzedwithin2hours.
Note:Inallcases,keepthepreparationsbetween2and8°Candprotectedfromlight.
PERFORMANCE
Performancedataareobtainedusingtheproceduredescribedaboveonsamplesspikedwithcelllinewithin24hoursofvenipuncturepreviouslycollectedon
steriletubeswithEDTAsaltasanticoagulantandstoredat18-25°C.Analysisisperformedwithin24hoursfollowingimmunostaining.
SPECIFICITY
CD103(αEβ7)belongstotheintegrinfamilymolecules.ItisaheterodimerconsistingofanαEsubunitandaβ7subunit.CD103isinmatureformcleaved
intotwodisulde-linkedchains(C-terminal150kDachainandN-terminal25kDachain).TheheterodimerizationofCD103withintegrinbeta7subunitleadto

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theformationofalphaE/beta7integrin(mucosallymphocyte1antigen).ThecomplexαEβ7isaligandforE-cadherin(whichismainlyexpressedinepithelial
cells)andaninteractionbetweenαEβ7andE-cadherinresultsinadhesionoflymphocytestoepithelialcells.CD103bindingtoE-cadherinmediateshomingof
lymphocytestotheintestinalepithelium,and,inadditiontotheroleinadhesion,mayserveasanaccessorymoleculeforintraepitheliallymphocyteactivation.
The2G5monoclonalantibody(mAb)stainsallthevarioussubsetsofhumanintraepitheliallymphocytes(IEL)aswellassubpopulationsoflaminapropriaT
cellsandmesentericlymphoblasts.Itreactsalsowithsomelymphocytesinothermucosae(9,10).
The2G5mAbhasbeenassignedtotheCD103clusterofdifferentiationduringthe5thInternationalWorkshoponHumanLeucocyteDifferentiationAntigens,
inBoston,USA,in1993(WSCode:A005)(11).
LIMITOFDETECTION
LIMITOFDETECTIONWITHVERSALYSE
AstudywasconductedinaccordancewithCLSIEP17-A2,EvaluationofDetectionCapabilityforClinicalLaboratoryMeasurementProcedures;Approved
Guideline-secondEdition(12).TheLimitofDetection(LOD)isthelowestconcentrationofanalytethatcanbeconsistentlydetected.Resultsobtainedare
summarizedinthefollowingtable:
PositiveTargetLimitofDetection
Molt16+CD103-FITC+1.0cell/μL
PRECISION
PRECISIONWITHVERSALYSE
Thepercentageofstainingofapositivetargetwasdeterminedusingtwowholebloodsamples,runintenreplicates,onthesamedayandusingthesame
cytometer.
Theresultsobtainedaresummarizedinthefollowingtable:
Mean(%)SDCV(%)
PositiveTargetNumber
Donor1Donor2Donor1Donor2Donor1Donor2
Molt16+CD103-FITC+10100.00100.000.010.010.010.01
LIMITATIONS
1.Flowcytometrymayproducefalseresultsifthecytometerhasnotbeenalignedperfectly,ifuorescenceleakshavenotbeencorrectlycompensated
forandiftheregionshavenotbeencarefullypositioned.
2.ItispreferabletouseaRBClysistechniquewithawashingstepasthisreagenthasnotbeenoptimizedfor"nowash"lysistechniques.
3.Accurateandreproducibleresultswillbeobtainedaslongastheproceduresusedareinaccordancewiththetechnicalinsertleaetandcompatible
withgoodlaboratorypractices.
4.Theconjugatedantibodyofthisreagentiscalibratedsoastoofferthebestspecicsignal/non-specicsignalratio.Therefore,itisimportanttoadhere
tothereagentvolume/samplevolumeratioineverytest.
5.Inthecaseofahyperleucocytosis,dilutethebloodinPBSsoastoobtainavalueofapproximately5x109leucocytes/L(13).
6.Incertaindiseasestates,suchassevererenalfailureorhaemoglobinopathies,lysisofredcellsmaybeslow,incompleteorevenimpossible.Inthis
case,itisrecommendedtoisolatemononucleatedcellsusingadensitygradient(Ficoll,forexample)priortostaining(14).
TRADEMARKS
BeckmanCoulter,thestylizedlogo,andtheBeckmanCoulterproductandservicemarksmentionedhereinaretrademarksorregisteredtrademarksof
BeckmanCoulter,Inc.intheUnitedStatesandothercountries.
SymbolsKey
GlossaryofSymbolsisavailableatbeckman.com/techdocs(documentnumberB60062)

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Spécications
SpécicitéCD103
Clone2G5
HybridomeNS1xbalb/c
ImmunogèneHumanintestinallymphocytes(HML1)
ImmunoglobulineIgG2a
EspècesSouris
PuricationChromatographied'afnité
FluorochromeFluoresceinisothiocyanate(FITC)
RatioMolaireFITC/Ig:5,0-7,0
λd’excitation488nm
Picd’émission525nm
TamponPBSpH7,2additionnéde2mg/mLBSAetde0,1%NaN3
IOT est
ConjugatedAntibody
CD103-FITC
B49222100tests;2mL,20µL/test
Pourunusagediagnostiqueinvitro.
UTILISATION
Cetanticorpsconjuguéauuorochromepermetl'identicationdespopulationsdecellulesexprimantl'antigèneCD103présentdanslesangpériphérique
humainenutilisantlacytométriedeux.
PRINCIPE
Cetestreposesurlacapacitéd’anticorpsmonoclonauxspéciquesdesexersurdescellulesleucocytairesparlesdéterminantsantigéniquesqu’elles
expriment.
Lemarquagespéciquedesleucocytesestréaliséenincubantl’échantillonavecleréactifIOT est.Lesérythrocytessontensuiteéliminésparlyseetles
leucocytes,nonaffectésparcetteétape,sontanalysésparcytométrieenux.
Lecytomètredeuxmesureladiffusiondelalumièreainsiquelauorescencedescellules.Ilpermetladélimitationdelapopulationd’intérêtàl'intérieur
d’unefenêtreélectronique,déniesurunhistogrammequicorrèleladiffusionorthogonaledelalumière("SideScatter"ouSS)etladiffusiondelalumière
auxanglesétroits(“ForwardScatter”ouFS).D’autreshistogrammescombinantdeuxdesdifférentsparamètresdisponiblessurlecytomètresontutilisables
commesupportsàl’étapedegatingélectroniqueenfonctiondel’applicationchoisieparl’utilisateur.
EXEMPLESD'APPLICATIONSCLINIQUES
LeCD103estexprimédansplusieurssous-ensemblesdelymphocytes,parmilesquelsunpetitsous-ensembledelymphocytespériphériques(lymphocytes
Trégulateurs),surleslymphocytesactivésetstimulésparTGF-bêta,surleslymphocytesintraépithéliauxintestinaux,leslymphocyteslaminapropria,
lescellulesdendritiquesépithélialesetlescellulesdendritiquesdérivéesdelalaminapropria.LescellulesdendritiquesCD103⁺delalaminapropriade
lamuqueuseintestinalesemblentjouerunrôleimportantdanslemaintiendel’homéostaseimmunitaireintestinaleinduisantdesréponsesimmunitaires
tolérogéniquesetimprimantdesmodicationsdephénotypesurleslymphocytesTspéciquesauxantigènes.
LesDCexprimantleCD103dansl’intestininduisentleslymphocytesTrégulateursFoxp3extraitsdeslymphocytesTFoxp3-CD4avecduTGF-βetdel’acide
rétinoïque(1,2).Enoutre,unepopulationdelymphocytesTCD8+CD103+aétédécriteaveclesfonctionsdeslymphocyteseffecteursetdeslymphocytes
Trégulateursparticipantentantqu’efférentsdanslerejetdel’allogreffeetentantquesuppresseursdelacytotoxicité/prolifération,respectivement(3,4).
LeCD103estinclusdanslepaneldistinctifpermettantlacaractérisationimmunophénotypiquedelaleucémieàtricholeucocytesquiinclutlescellules
anormalementlumineusesCD20+CD22+,CD11c+,CD25+,positivesCD103+,CD123+associéesàdescellulesnégativesCD5-,CD10-etCD23-(5,6,7,8).
RÉACTIFS
Concentration:voirlecerticatd'analysespéciquedulotsurwww.beckmancoulter.com.
AVERTISSEMENTSETPRÉCAUTIONS
1.Nepasutiliserleréactifau-delàdeladatedepéremption.
2.Nepascongeler.
3.Laisserreveniràtempératureambiante(18–25°C)avantutilisation.
4.Minimiserlestempsd’expositionàlalumière.
5.Eviterlacontaminationmicrobiennedesréactifsoudesrésultatserronéspeuventapparaître.
6.Lessolutionsd'anticorpscontenantdel'azoturedesodium(NaN3)sontàmanipuleravecprécaution.Nepasavaleretévitertoutcontactaveclapeau,
lesmuqueusesetlesyeux.
Parailleurs,enmilieuacide,l'azoturedesodiumpeutformerdel'acidehydrazoïquepotentiellementdangereux.Lorsdel'élimination,ilestrecommandé
dediluerleréactifdansungrandvolumed'eauavantdeleverserdanslesystèmed'évacuationdeseauxpouréviterl'accumulationd'azoturedesodium
danslescanalisationsmétalliquesetprévenirlerisqued'explosion.
7.Toutéchantillonsanguindoitêtreconsidérécommepotentiellementinfectieuxetdoitêtremanipuléaveclesprécautionsd'usage(enparticulier:port
degants,deblouseetdelunettesdeprotection).
8.Nejamaispipeteràlaboucheetévitertoutcontactdeséchantillonsaveclapeau,lesmuqueusesetlesyeux.
9.Lestubesdesangetlematérielàusageuniqueayantserviàlamanipulationdoiventêtreéliminésdansdesconteneursadhocdestinésàl'incinération.
10.Lesréactifsetlesdéchetsdoiventêtreéliminésconformémentauxexigenceslocales.

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CLASSIFICATIONDESRISQUESSGH
Nonclassiécommedangereux
Lachetechniquesanté-sécuritéestdisponibleà
l’adressetechdocs.beckman.com
CONSERVATIONETSTABILITE
Lesconjuguéssousformeliquidedoiventêtreconservésentre2et8°Càl'abridelalumière,avantetaprèsouvertureduacon.
Stabilitéaconfermé:voirladatedepéremptionduréactifindiquéesurleacon.
Stabilitéduaconouvert:leréactifeststablependant180jours.
ÉCHANTILLONS
Lesprélèvementsdesangveineuxdoivents'effectuersurtubesstérilescontenantunseld'EDTAcommeanticoagulant.
Leséchantillonsseconserventàtempératureambiante(18–25°C)etsansagitation.Avantd'effectuerlaprised'essai,ilestrecommandéd'homogénéiser
leprélèvementparagitationdouce.
Leséchantillonsdoiventêtreanalysésdansles24heuresquisuiventleprélèvement.
PREUVEDEDÉTÉRIORATION
toutchangementd’apparencephysiqueduproduitpeutindiquerunedeteriorationetleproduitnedoitpasêtreutiliser.
Encasdedétériorationdel'emballageousilesdonnéesobtenuesindiquentcertainesaltérationsdesperformances,veuillezcontacternotreserviceSupport
Technique:0491172727Fax:[e-mail]
CONTENU
L’azoturedesodium,utilisécommeagentdeconservation,peutréagiraveclemétaldescanalisationsetformerdescomposésexplosifs.VoirleNIOSH
Bulletin:ExplosiveAzideHazards(8/16/76)(Bulletindel’Institutnationalpourlasantéetlasécuritéautravail:Lesdangersd’explosiondesazotures
(16/08/1976)).
Pouréviterl’accumulationpotentielledescomposésd’azoture,rincerlestuyauxd’évacuationàl’eauaprèsl’éliminationderéactifsnondilués.L’élimination
del’azoturedesodiumdoitsefaireconformémentauxréglementationslocalesenvigueur.
MATERIELNECESSAIREMAISNONFOURNIAVECCECOFFRET:
•Tubesàprélèvementetmatérielnécessaireauxprélèvements.
•Pipettesautomatiquesavecemboutsjetablespour20,100et500µL.
•Tubesàhémolyseenplastique.
•Billesdecalibration:Flow-SetProFluorospheres(Ref.A63492)Flow-CheckProFluorospheres(Ref.A63493)
•Réactifdelysedesérythrocytesavecétapedelavageaprèslyse.Atitred’exemple:VersaLyse(Réf.A09777).
•Réactifdexationdesleucocytes.Atitred’exemple:SolutiondeFixationIOTest3(Réf.A07800).
•ContrôleisotypiqueFITC:réactifIOTest(Réf.A12689).
•Tampon(PBS:0,01Mphosphatedesodium;0,145Mchloruredesodium;pH7,2).
•Centrifugeuse.
•Agitateurautomatique(typeVortex).
•Cytomètreenux.
PROCÉDURE
ProcédureavecréactifVersaLyse
Pourchaqueéchantillonanalysé,prévoirenplusdutubetest,untubecontrôledanslequellescellulesserontmisesenprésenceducontrôleisotypique(réf.
A12689).
1.Ajouter20µLd'anticorpsconjuguéspéciqueIOTestàchaquetubetestet20µLdecontrôleisotypiquedanschaquetubedecontrôle.
2.Ajouter100µLdel’échantillonàtesterdansles2tubes.Vortexerdoucement.
3.Incuber15à20minutesàtempératureambiante(18–25°C)etàl'abridelalumière.
4.Effectuerensuiteunelysedesérythrocytes,ensuivantlesrecommandationsduréactifdelyseutilisé.
Atitred’exemple,sil’onsouhaiteutiliserVersaLyse(Réf.A09777),sereporteràlanoticeetsuivredepréférencelaprocéduredite«avecxation
concomitante»quiconsisteàajouter1mLdumélange“Fix-and-Lyse”préparéextemporanément.Vortexerimmédiatementunesecondeetincuber
10minutesàtempératureambianteetàl'abridelalumière.
5.Centrifugerà150xgpendant5minutesàtempératureambiante.
6.Eliminerlesurnageantparaspiration.
7.Resuspendreleculotcellulairedans3mLdePBS.
8.Répéterl’étape5.
9.Eliminerlesurnageantparaspirationetresuspendreleculotcellulairedans:
0,5mLdePBSplus0,1%deformaldéhydesilespréparationssontdestinéesàêtreconservéesmoinsde24heures.(LePBSà0,1%deformaldéhyde
peutêtreobtenupardilution12,5µLdelasolutiondexationIOTest3(réf.A07800)àsaconcentration10Xdans1mLdePBS).
0,5mLdePBSsansformaldéhyde,silespréparationsdoiventêtreanalyséesdansles2heures.
NotaBene:Conserverlespréparationsentre2et8°Cetàl'abridelalumière.
PERFORMANCES

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Lesdonnéesdeperformancesontobtenuesàl’aidedelaprocéduredécriteci-dessussurdeséchantillonsinjectésd’unelignedecellulesdansles24heures
suivantlaponctionveineusepréalablementcollectéedansdestubesstérilescontenantduseld’EDTAentantqu’anticoagulantetstockésentre18et25°C.
L’analyseestréaliséedansles24heuressuivantl’immunocoloration.
SPECIFICITE
LeCD103(αEβ7)appartientauxmoléculesdelafamilledesintégrines.Ils’agitd’unhétérodimèrecomposéd’unesous-unitéαEetd’unesous-unitéβ7.
LeCD103,soussaformemature,estdiviséendeuxchaînesliéespardespontsdisulfures(chaîneC-terminal150kDaetchaîneN-terminal25kDa).
L’hétérodimérisationduCD103auseindelasous-unitéd’intégrinebêta7aboutitàlaformationdel’intégrinealphaE/bêta7(antigènedelymphocyte
mucosal1).LecomplexeαEβ7estunligandpourl’E-cadhérine(quiestexpriméprincipalementdansleschaînesépithéliales)etuneinteractionentre
leαEβ7etl’E-cadhérineprovoquel’adhésiondeslymphocytesauxcellulesépithéliales.LaliaisonduCD103àl’E-cadhérineassurelamédiationdu
déplacementdeslymphocytesversl’épithéliumintestinal.Outresonrôledansl’adhésion,ilpeutservirdemoléculeaccessoirepourl’activationdes
lymphocytesintra-épithéliaux.
L’anticorpsmonoclonal2G5(mAb)coloretouslesdifférentssous-ensemblesdelymphocytesintra-épithéliauxhumains(LIH),ainsiquelessous-populations
delymphocytesTdelalaminapropriaetleslymphoblastesmésentériques.Ilréagitégalementàcertainslymphocytesprésentsdansd’autresmuqueuses
(910).
Le2G5mAbaétéassignéàlaclassededifférenciationCD103lorsdu5egroupedetravailetconférenceinternationalesurlesantigènesdesleucocytes
humains,àBoston,auxÉtats-Unis,en1993(CodeWS:A005)(11).
LIMITEDEDÉTECTION
LIMITEDEDÉTECTIONAVECVERSALYSE
UneétudeaétémenéeconformémentàCLSIEP17-A2,(EvaluationofDetectionCapabilityforClinicalLaboratoryMeasurementProcedures;Approved
Guideline-secondEdition(12).Lalimitededétection(LOD)estlaplusfaibleconcentrationd'analytequipeutêtresystématiquementdétectée.Lesrésultats
obtenussontrésumésdansletableausuivant:
CiblepositiveLimitededétection
Molt16+CD103-FITC+1,0cell/μL
PRÉCISION
PRÉCISIONAVECRÉACTIFVERSALYSE
Lepourcentagedemarquaged'uneciblepositiveaétédéterminéaumoyendedeuxéchantillonsdesangtotal,exécutésendixréplicats,lemêmejouret
enutilisantlemêmecytomètre.
Lesrésultatssontregroupésdansletableausuivant:
Moy.(%)SDCV(%) CiblepositiveNombre
Donneur1Donneur2Donneur1Donneur2Donneur1Donneur2
Molt16+CD103-FITC+10100,00100,000,010,010,010,01
LIMITES
1.Lesrésultatsdecytométrieenuxpeuventêtreerronéssilecytomètren'estpasparfaitementaligné,lesfuitesdeuorescencenesontpas
correctementcompenséesetlesrégionsdedélimitationnesontpassoigneusementplacées.
2.Utiliserdepréférenceunetechniquedelysedesglobulesrougesaveclavagecarceréactifn'apasétéoptimisépourlestechniquesdelysedites
"sanslavage".
3.Onobtiendradesrésultatsprécisetreproductiblesdanslamesureoùlesprocéduresutiliséessontconformesauxinstructionsdeschestechniques
etcompatiblesaveclesbonnespratiquesdelaboratoire.
4.L'anticorpsconjuguédeceréactifestcalibréand'offrirlemeilleurrapportsignalspécique/signalnonspécique.C'estpourquoiilestimportantde
respecterlerapportvolumeduréactif/volumedel'échantillonpourchaquetest.
5.Danslecasdel'hyperleucocytose,diluerlesangdansduPBSand'obtenirunevaleurd'environ5x109leucocytes/L(13).
6.Danscertainsétatspathologiques,tellesqu'unegraveinsufsancerénaleouunehémoglobinopathie,lalysedesérythrocytespeutêtrelente,
incomplèteoumêmeimpossible.Danscecas,ilestrecommandéd'isolerlescellulesmononuclééesenutilisantungradientdedensité(Ficoll,par
exemple)avantlemarquage(14).
MARQUES
BeckmanCoulter,lelogostyliséetlesmarquesdesproduitsetdesservicesBeckmanCoultermentionnéesicisontdesmarquesoudesmarquesdéposées
deBeckmanCoulter,Inc.auxÉtats-Unisetdansd’autrespays.
Légendedessymboles
Glossairedessymbolesdisponiblessurlapagebeckman.com/techdocs(documentnuméroB60062)

B77267–AC8of76
Spezikationen
SpezitätCD103
Klon2G5
HybridomNS1xbalb/c
ImmunogenHumanintestinallymphocytes(HML1)
ImmunglobulinIgG2a
ArtMaus
ReinigungAfnitätschromatographie
FluorochromFluoresceinisothiocyanate(FITC)
MolaresVerhältnisFITC/Ig:5,0-7,0
Anregungs-λ488nmnm
Emissionspeak525nmnm
PufferPBSpH7,2plus2mg/mLBSAund0,1%NaN3
IOT est
ConjugatedAntibody
CD103-FITC
B49222100tests;2mL,20µL/Test
In-vitro-Diagnostikum.
VERWENDUNGSZWECK
MithilfederDurchusszytometrieermöglichtdieseruorochrom-konjugierteAntikörperdieIdentizierungvonZellpopulationen,diedasCD103-Antigenim
peripherenHumanblutexprimieren.
PRINZIP
DieserTestberuhtaufderFähigkeitvonspezischenmonoklonalenAntikörpern,sichmitHilfedervondenLeukozytenexprimiertenAntigendeterminanten
spezischandieLeukozytenzubinden.
DiespezischeMarkierungderLeukozytenerfolgtdurchInkubationderProbemitdemIOTest-Reagenz.DieErythrozytenwerdenanschließenddurcheine
Lyseeliminiert.DievondiesemProzessverschontenLeukozytenwerdenimDurchusszytometeruntersucht.
DasDurchusszytometermisstdieLichtverteilungsowiedieFluoreszenzderZellen.DabeiwirddieTarget-PopulationinnerhalbeinesineinemHistogramm
deniertenelektronischenFenstersuntersucht,dasdieSeitwärtslichtstreuung("SideScatter"oderSS)sowiedieVorwärtslichtstreuung("ForwardScatter“
oderFS)wiedergibt.JenachvomBedienergewählterAnwendungsindauchandereHistogramme,diezweideramZytometervorhandenenParameter
kombinieren,alsGrundlagezumelektronischenGatingmöglich.
BEISPIELEKLINISCHERANWENDUNGEN
CD103kommtaufmehrerenLymphozytuntergruppen,einschließlicheinerUntergruppeperiphererLymphozyten(TReg-Zellen),aufaktiviertenund
TGF-ß-stimuliertenLymphozyten,aufintestinalenintraepithelialenLymphozyten,aufLymphozyteninderLaminaPropria,aufdendritischenEpithelzellen
sowieaufvonderLaminaPropriaabgeleitetendendritischenZellenvor.DendritischeCD103⁺-ZelleninderintestinalenmukosalenLaminaPropriascheinen
einewesentlicheRollebeiderAufrechterhaltungderintestinalenImmunhomöostasezuspielen,dasietolerogeneImmunreaktionenhervorrufenund
phänotypischeVeränderungenanantigenspezischenT-Zellenausprägen.
DendritischeZellen,dieCD103imDarmexprimieren,rufenFoxp3-TReg-ZellenausFoxp3-CD4-T-ZellenmitendogenemTGF-βundRetinsäurehervor
(1,2).DarüberhinauswurdeeinePopulationvonCD8+-undCD103+-ZellenmitEffektor-undTReg-Zellenfunktionenbeschrieben,diealsEfferenz
beiderAllotransplantatabstoßungbzw.alsHemmstoffderZytotoxizität/Proliferationmitwirkt(3,4).CD103istindemPanelenthalten,dasfürdie
ImmunophänotypisierungvonHaarzellleukämietypischist.DarinenthaltensindungewöhnlichhellesCD20+,CD22+,CD11c+,CD25+,positivesCD103+,
CD123+inZusammenhangmitnegativemCD5-,CD10-undCD23-(5,6,7,8).
REAGENZIEN
Konzentration:SiehechargenspezischesAnalysezertikatunterwww.beckmancoulter.com.
WARNUNGENUNDVORSICHTSMASSNAHMEN
1.DasReagenznichtüberdasHaltbarkeitsdatumhinausanwenden.
2.Nichteinfrieren.
3.VorderAnwendungaufRaumtemperatur(18–25°C)erwärmenlassen.
4.LichteinstrahlungaufeinMinimumbegrenzen.
5.KontaminationdurchMikroorganismenderReagenzienvermeiden.DieskönntezufalschenErgebnissenführen.
6.Antikörperlösungen,dieNatriumazid(NaN3)enthalten,solltenvorsichtigbehandeltwerden.VerschluckenundjeglichenKontaktmitderHaut,den
SchleimhäutenunddenAugenvermeiden.
ZudemkannNatriumazidineinemsaurenMediumpotentiellgefährlichesAzoimidbilden.ZurEntsorgungwirdempfohlen,dasReagenzineiner
großenMengeWasserzuverdünnenundesanschließendindenAbusszugießen.SokanneineAnhäufungvonNatriumazidindenMetallleitungen
vermiedenundeinerExplosionsgefahrvorgebeugtwerden.
7.JedeBlutprobemussalspotentiellinfektiösbetrachtetunddahermitdenüblichenVorsichtsmaßnahmengehandhabtwerden(insbesondereTragen
vonHandschuhen,KittelundSchutzbrille).
8.NiemitdemMundpipettierenundjeglichenKontaktderProbenmitderHaut,denSchleimhäutenunddenAugenvermeiden.
9.DieBlutröhrchenunddaszurHandhabungverwendeteEinwegmaterialmüsseninzurVerbrennungvorgesehenenadhoc-Containernentsorgtwerden.
10.ReagenzienundAbfallmüssenentsprechenddenlokalenRichtlinienentsorgtwerden.

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GHS-GEFAHRSTOFFKLASSIFIZIERUNG
Nichtalsgefährlicheingestuft
DasSicherheitsdatenblattistaufbeckman.com/techdocs
verfügbar.
LAGERUNGUNDSTABILITÄT
DieüssigenkonjugiertenFormenwerdenvorundnachÖffnendesFläschchensbei2bis8°CvorLichteinstrahlunggeschütztaufbewahrt.
StabilitätdesgeschlossenenFläschchens:sieheHaltbarkeitsdatumdesReagenzesaufdemFläschchen.
StabilitätdesgeöffnetenFläschchens:dasReagenzist180Tagelangstabil.
PROBEN
DieBlutabnahmenvonvenösemBlutmüssenmitsterilenRöhrchenvorgenommenwerden,dieeinEDTA-SalzalsgerinnungshemmendeSubstanzenthalten.
DieProbenmüssenbeiRaumtemperatur(18–25°C)undruhendaufbewahrtwerden.VorDurchführungdesTestswirdempfohlen,dieProbedurchleichtes
Schüttelnzuhomogenisieren.
DieProbenmüsseninnerhalbvon24StundennachderProbeentnahmeanalysiertwerden.
VERFALLSANZEICHEN
JeglicheVeränderungderphysikalischenEigenschaftenderReagenzienkannaufeineAlterunghinweisen,dasReagenzsolltedannnichtmehrverwendet
werden.
WenndieVerpackungbeschädigtistoderdieerhaltenenDatenirgendwelcheLeistungsänderungenanzeigen,kontaktierenSieIhrenlokalenVertriebshändler
oderwendensichanfolgendeE-Mail-Adresse:[e-mail]
INHALT
NatriumazidalsKonservierungsmittelkanninmetallischenAbussleitungenexplosiveVerbindungeneingehen.SiehehierzuNIOSHBulletin:Explosive
AzideHazards(dasBulletinbezüglichexplosiverSäurendesUS-amerikanischenInstitutsfürSicherheitamArbeitsplatz)(16.08.1976).
UmeinemöglicheAkkumulationvonAzidverbindungenzuvermeiden,dieAbwasserrohrenachderEntsorgungdesunverdünntenReagenzesmitWasser
spülen.NatriumazidmussentsprechenddenörtlichenbehördlichenVorschriftenentsorgtwerden.
BENÖTIGTE,JEDOCHNICHTIMKITENTHALTENEARTIKEL:
•RöhrchenzurBlutabnahmeundweiteresfürdieBlutabnahmeerforderlichesMaterial.
•AutomatischePipettenmitEinwegspitzenfür20,100und500µL.
•HämolyseröhrchenausKunststoff.
•Kalibrierpartikel:Flow-SetProFluorospheres(Ref.A63492)Flow-CheckProFluorospheres(Ref.A63493)
•LysereagenzfürErythrozytenmitWaschschrittnachderLyse.ZumBeispiel:VersaLyse(Art.A09777).
•FixationsreagenzfürLeukozyten.ZumBeispiel:IOT est3Fixationslösung
•IsotypkontrolleFITC:IOTest-Reagenz(Ref.A12689).
•Puffer(PBS:0,01MNatriumphosphat;0,145MNatriumchlorid;pH7,2).
•Zentrifuge.
•AutomatischerRüttler(TypVortex).
•Durchusszytometer.
DURCHFÜHRUNG
VerfahrenmitVersaLyse-Reagenz
FürjedeanalysierteProbewird,zusätzlichzumTeströhrchen,einKontrollröhrchenempfohlen,indemdieZelleninGegenwartderIsotypkontrollegemischt
werden(Ref.A12689).
1.20µLdesspezischen,konjugiertenIOTest-AntikörpersinjedesTeströhrchenund20µLderIsotypkontrolleinjedesKontrollröhrchengeben.
2.100µLderTestprobeinbeideRöhrchenhinzufügen.DieRöhrchenvorsichtigmischen.
3.15bis20MinutenbeiRaumtemperatur(18–25°C)undvorLichteinstrahlunggeschütztinkubieren.
4.AnschließenddieLysederErythrozytengemäßdenEmpfehlungenfürdasverwendeteLysereagenzdurchführen.
WennSiez.B.VersaLyse(Art.A09777)verwendenmöchten,solltenSiesichnachderAnleitungrichtenundambestendasVerfahren“mit
gleichzeitigerFixation“anwenden,dasdarinbesteht1mLderfrischzubereiteten“Fix-and-Lyse”-Mischunghinzufügen.SoforteineSekundelang
rüttelnund10MinutenbeiRaumtemperaturundvorLichteinstrahlunggeschütztinkubieren.
5.5Minutenbei150xgundRaumtemperaturzentrifugieren.
6.ÜberständedurchAbsaugenentfernen.
7.Zellpelletin3mLPBSresuspendieren.
8.Schritt5wiederholen.
9.ÜberständedurchAbsaugenentfernenundZellpelletresuspendierenin:
0,5mLPBSplus0,1%Formaldehyd,wenndiePräparatewenigerals24Stundenaufbewahrtwerdensollen.(Einen0,1%-iger
Formaldehyd-PBS-Resuspensionspuffererhältman,durchVerdünnungvon12,5µLderIOTest3Fixierlösung(Ref.A07800)in10-facher
Konzentrationmit1mLPBS).
0,5mLPBSohneFormaldehyd,wenndiePräparateinnerhalbvon2Stundenanalysiertwerdensollen.
HINWEIS:DieProbenmüssenzwischen2und8°CundvorLichteinstrahlunggeschütztaufbewahrtwerden.

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LEISTUNG
LeistungsdatenwerdendurchVerwendungdesobenbeschriebenenVerfahrensanProbenerhoben,dieinnerhalbvon24StundenderVenenpunktionmit
einerZellenlinieaufgestocktwurden.DieseProbenwurdeninsterileProbenröhrchenmitEDTA-SalzalsAntikoagulanzgefülltundbei18°Cbis25°C
gelagert.DieAnalysewurdeinnerhalbvon24StundennachderImmunmarkierungdurchgeführt.
SPEZIFITÄT
CD103(αEβ7)gehörtzurMolekülfamiliederIntegrine.EsisteinDimer,dasauseinerαE-Untereinheitundeinerβ7-Untereinheitbesteht.InreiferForm
istCD103inzweiüberDisuldbrückenmiteinanderverbundeneKettengespalten(C-Terminus-Kettevon150kDaundN-Terminus-Kettevon25kDa).Die
HeterodimerisierungvonCD103mitderIntegrin-β7-UntereinheitführtezurBildungdesαE/β7-Integrins(mukosalesLymphozyt-1-Antigen).DerKomplex
αEβ7isteinLigandfürE-Cadherin(welcheshauptsächlichinEpithelzellenvorkommt).EineInteraktionzwischenαEβ7undE-Cadherinführtdazu,dass
LymphozytenanEpithelzellenanhaften.DurchdieBindungvonCD103anE-CadherinkehrendieLymphozytenzumDarmepithelzurück.Zudemkann
CD103nebenseinerRollealsHaftstoffauchalsStartermolekülzurAktivierungderintraepithelialenLymphozytenfungieren.
Dermonoklonale2G5-Antikörper(mAk)färbtdieverschiedenenUntergruppenvonmenschlichenintraepithelialenLymphozyten(IEL)sowieSubpopulationen
vonT-ZelleninderLaminaPropriaundmesenterialeLymphoblasten.EsreagiertaußerdemmiteinigenLymphozyteninanderenSchleimhäuten(,910).
Der2G5-mAkwurdebeimfünfteninternationalenWorkshopzumenschlichenLeukozyten-DifferenzierungsantigeneninBoston,USAimJahr1993der
CD103-Unterscheidungsgruppezugeordnet(WSCode:A005)(11).
NACHWEISGRENZE
NACHWEISGRENZEMITVERSALYSE
GemäßCLSI-RichtlinieEP17-A2,(EvaluationofDetectionCapabilityforClinicalLaboratoryMeasurementProcedures;ApprovedGuideline-secondEdition
(12).DieNachweisgrenze(LOD)istdieniedrigste,kontinuierlichnachweisbareKonzentrationdesAnalyten.DiegewonnenErgebnissesindinderfolgenden
Tabellezusammengefasst:
Positiv-TargetErkennungsgrenzwert
Molt16+CD103-FITC+1,0cell/μL
PRÄZISION
PRÄZISIONMITVERSALYSE
DerProzentsatzderFärbungeinespositivenZielswurdeanhandvonzweiVollblutprobenbestimmt,mitdenenamgleichenTagundaufdemgleichen
ZytometerzehnMehrfachbestimmungendurchgeführtwurden.
DieErgebnissesindinderfolgendenTabellezusammengefasst:
Durchschnitt(%)SAVK(%)
Positiv-TargetReferenznummer
Spender1Spender2Spender1Spender2Spender1Spender2
Molt16+CD103-FITC+10100,00100,000,010,010,010,01
EINSCHRÄNKUNGEN
1.DieDurchusszytometriekannfalscheErgebnisseliefern,wenndasZytometernichtrichtigjustiertwurde,dieFluoreszenzlecksnichtrichtig
kompensiertwurdenunddieRegionennichtrichtigpositioniertsind.
2.VorzugsweisesollteeineLysetechnikderErythrozytenmitWaschschrittenangewendetwerden,dadiesesReagenznichtfürLysetechnikenohne
Waschschritteoptimiertwurde.
3.GenaueundreproduzierbareErgebnissewerdenerzielt,wenndieangewendetenVerfahrendenAnleitungenderDatenblätterundderrichtigen
Laborpraxisentsprechen.
4.DerkonjugierteAntikörperdiesesReagenzeswirdsokalibriert,dassdasbestespezische/nicht-spezischeSignalverhältniserzieltwird.Deshalbist
eswichtig,dasVerhältnisReagenz-/ProbenvolumeninjedemTesteinzuhalten.
5.ImFalleeinerHyperleukozytose,verdünnenSiedasBlutinPBS,bisSieeinenWertvonca.5x109Leukozyten/lerhalten(13).
6.BeibestimmtenKrankheitsbildern,wiebeispielsweiseschweremNierenversagenoderHämoglobinopathienkanndieLysederErythrozytenlangsam,
unvollständigodergarnichtablaufen.IndiesemFallwirdempfohlen,diemononukleärenZellenmithilfeeinesDichtegradienten(z.B.Ficoll)vordem
Färbenzuisolieren(14).
HANDELSMARKEN
BeckmanCoulter,dasstilisierteLogounddieindiesemDokumenterwähntenBeckmanCoulter-Produkt-und-DienstleistungsmarkensindindenUSAund
anderenLänderneingetrageneMarkenvonBeckmanCoulter,Inc.
ListederSymbole
DasGlossarderSymboleistaufbeckman.com/techdocs(DokumentnummerB60062)verfügbar.

B77267–AC11of76
Caratteristiche
SpecicitàCD103
Clone2G5
IbridomaNS1xbalb/c
ImmunogeniHumanintestinallymphocytes(HML1)
ImmunoglobulinaIgG2a
SpecieTopo
PuricazioneCromatograadiafnità
FluorocromoFluoresceinisothiocyanate(FITC)
rapportomolareFITC/Ig:5,0-7,0
λd’eccitazione488nm
Piccod’emissione525nm
TamponePBSpH7,2addizionatocon2mg/mLdiBSAelo0,1%diNaN3
IOT est
ConjugatedAntibody
CD103-FITC
B49222100tests;2mL,20µL/test
Perusodiagnosticoinvitro.
USOPREVISTO
Questoanticorpoconiugatoconuorocromoconsentel'identicazionedipopolazionicellularicheesprimonol'antigeneCD103presentenelsangueperiferico
umanomediantecitometriaausso.
PRINCIPIO
Ilprincipiosulqualesibasaquestotestèlacapacitàdeglianticorpimonoclonalispecicidissarsisualcunecelluleleucocitariemedianteideterminanti
antigenicicheesseesprimono.
Lamarcaturaspecicadeileucocitiavvienetramitel’incubazionedelcampioneconilreagenteIOTest.Successivamente,glieritrocitivengonoeliminati
tramitelisieileucociti,noncoinvoltiinquestafase,vengonoanalizzatiincitometriaausso.
Ilcitometroaussomisuraladiffusionedellalucenonchélauorescenzadellecellule.Questostrumentoconsentedicircoscriverelapopolazione
interessataall’internodiunanestradianalisiinunistogrammachecorrelaladiffusioneortogonaledellaluce("SideScatter"oSS)alladiffusioneassiale
(“ForwardScatter”oFS).Gliistogrammi,checorrelanoduedeiparametridisponibilisulcitometro,costituisconounsupportoallafasedigatinginfunzione
dell’applicazionesceltadall’utente.
ESEMPIDIAPPLICAZIONICLINICHE
CD103siesprimeindiversisottogruppidilinfocitiinclusiunpiccolosottogruppodilinfocitiperiferici(celluleTreg),neilinfocitiattivatielinfocitistimolati
TGF-beta,neilinfocitiintraepitelialidell’intestino,neilinfocitidellalaminapropria,nellecelluledendriticheepitelialienellecelluledendritichederivantidalla
laminapropria.LecelluledendriticheCD103⁺dellalaminapropriadellamucosaintestinalesvolgonounruoloimportantenelmantenimentodell’omeostasi
immunitariaintestinaleinducendorisposteimmunologichetollerogenicheecomportandocambiamentifenotipicinellecelluleTspecichedell’antigene.
LeDCcheesprimonoCD103nell’intestinoinduconoFoxp3T-regprovenientidallecelluleTFoxp3-CD4conTGF-βendogenoeacidoretinoico(1,2).Inoltre,
unapopolazionedicelluleTCD8+CD103+èstatadescrittaconfunzionidicelluleeffettriciedicelluleTregolatoriechepartecipanocomeefferentinelrigetto
deltrapiantoecomesoppressoririspettivamentedellacitotossicitàedellaproliferazione(3,4).CD103èinclusonelpannellorelativoallacaratterizzazione
immunofenotipicadellaleucemiaacellulecapellutecheincludeCD20+CD22+,CD11c+,CD25+,CD103+positivo,CD123+insolitamentebrillantiassociati
aCD5-,CD10-eCD23-negativi(5,6,7,8).
REAGENTI
Concentrazione:vedereilcerticatodianalisispecicoperillottosuwww.beckmancoulter.com.
AVVERTENZEEPRECAUZIONI
1.Nonutilizzareilreagentedopoladatadiscadenza.
2.Noncongelare.
3.Attenderecheilaconeraggiungalatemperaturaambiente(18–25°C)primadiutilizzarlo.
4.Ridurrealminimol’esposizioneallaluce.
5.Evitarelacontaminazionemicrobicadeireagentiondeevitarel’apparizionedirisultatierrati.
6.Lesoluzionianticorpalichecontengonosodioazide(NaN3)devonoesseremaneggiateconcura.Noningerireedevitareilcontattoconlapelle,le
mucoseegliocchi.
Inoltre,inunmezzoacido,sodioazidepuòformareilpericolosoacidoidrazoico.Sesipresentalanecessitàdismaltirlo,siraccomandadidiluireil
reagenteinunagrandequantitàdiacquaprimadiversarlonelsistemadidrenaggioperevitarel'accumulodisodioazidenelletubaturedimetalloe
prevenireilrischiodiesplosione.
7.Ognisingolocampionedisanguedeveessereconsideratopotenzialmenteinfettivoedeveesseremanipolatoseguendoleappositeprecauzionid’uso
(inparticolare,siraccomandadiindossareguanti,camiceeocchialiprotettivi).
8.Nonpipettareconlaboccaedevitareilcontattodeicampioniconlapelle,lemucoseegliocchi.
9.Leprovettedisangueeilmaterialeusaegettautilizzatoperlamanipolazionedevonoesseresmaltitiinappositirecipientidestinatiall’incenerimento.
10.Reagentieriutidevonoessereeliminatiinconformitàallenormativeinvigore.
CLASSIFICAZIONEPERICOLIGHS
Classicatononpericoloso

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Laschedatecnicasullasicurezzaèdisponibile
all’indirizzobeckman.com/techdocs
CONSERVAZIONEESTABILITÀ
Leformeliquideconiugatedevonoessereconservateaunatemperaturacompresatrai2egli8°Cealriparodallaluce,primaedopol'aperturadellaala.
Stabilitàaconechiuso:vedereladatadiscadenzadelreagenteindicatasulacone.
Stabilitàdiunaalaaperta:ilreagenteèstabileper180giorni.
CAMPIONI
IlsanguevenosodaanalizzaredeveesseremessoinprovettesterilicontenentiEDTAcomeanticoagulante.
Icampionivannoconservatiatemperaturaambiente(18–25°C)senzaagitare.Primadieffettuareiltest,siraccomandadiomogeneizzareilcontenuto
dellaprovettaagitandolaleggermente.
Icampionidevonoessereanalizzatientro24oredalprelievo.
INDICIDIDETERIORAMENTO
Qualsiasicambiamentonell’aspettosicodeireagentipotrebbeindicareundeterioramento;intalcaso,ilreagentenondeveessereutilizzato.
Incasodideterioramentodell'imballaggiooseidatiottenutipresentanoalcunealterazioninelleprestazioni,rivolgersialdistributorelocaleoinviareun'e-mail
alseguenteindirizzo:
SOMMARIO
Ilconservantesodioazidepuòformarecompostiesplosivinelletubazionimetallichediscarico.VedereilNIOSHBulletin:“ExplosiveAzideHazard”(Bollettino
NIOSH:Rischidiesplosionedovutialsodioazide)(16/8/1976).
Perevitareilpossibileaccumulodiazidi,lavareitubidiscaricoconacquadopolosmaltimentodelreagentepuro.Ilsodioazidedeveesseresmaltitoin
conformitàallenormedileggelocaliapplicabili.
MATERIALINECESSARIMANONFORNITICONILKIT
•Provetteperprelievoematerialenecessarioaiprelievi.
•Pipetteautomaticheconpuntalimonousoper20,100e500µL.
•Provettediplasticapereffettuarel’emolisi.
•Sferedicalibrazione:Flow-SetProFluorospheres(Ref.A63492)Flow-CheckProFluorospheres(Ref.A63493)
•Reagentedilisideglieritrociticonlavaggiosuccessivoallalisi.Atitolodiesempio:VersaLyse(Rif.A09777).
•Reagentessantedeileucociti:Atitolodiesempio:SoluzioneFissanteIOTest3
•ControlloisotipicoFITC:reagenteIOTest(Rif.A12689).
•Tampone(PBS:0,01Mfosfatodisodio;0,145Mclorurodisodio;pH7,2).
•Centrifuga.
•Agitatoreautomatico(tipoVortex).
•Citometroausso.
PROCEDURA
ProceduraconreagenteVersaLyse
Perognicampioneanalizzato,oltreallaprovetta,siconsigliadiutilizzareunaprovettadicontrolloincuimiscelarelecelluleinpresenzadicontrolloisotipico
(Rif.A12689).
1.Aggiungere20µLdianticorpiconiugatiIOTestinciascunaprovettae20µLdicontrolloisotipicoinciascunaprovettadicontrollo.
2.Aggiungere100µLdicampionedaanalizzareinentrambeleprovette.MiscelaredelicatamenteleprovetteconVortex.
3.Incubareper15-20minutiatemperaturaambiente(18–25°C)ealriparodallaluce.
4.Quindieseguirelalisideglieritrocitiattenendosialleraccomandazioniperilreagentedilisiutilizzato.
Atitolodiesempio,qualorasidesiderasseutilizzareVersaLyse(Rif.A09777),vederelaschedatecnicaeseguirepreferibilmentelaprocedura«con
ssaggioconcomitante»checonsistenell’aggiungere1mLdiunamisceladi“Fix-and-Lyse”,preparataestemporaneamente.Agitareimmediatamente
alVortexperunsecundoeincubareper10minutiatemperaturaambienteealriparodallaluce.
5.Centrifugareper5minutia150xgeatemperaturaambiente.
6.Eliminareilsurnatantetramiteaspirazione.
7.Risospendereilpellet(fondello)cellularein3mLdiPBS.
8.Ripetereilpunto5.
9.Eliminareilsurnatantetramiteaspirazioneerisospendereilpelletcellularein:
0,5mLdiPBSpiù0,1%diformaldeide,seipreparatidevonoessereconservatimenodi24ore.(ÈpossibileottenerePBSconformaldeideallo0,1%
diluendo12,5µLdiIOTest3FixativeSolution(Rif.A07800)allasuaconcentrazionedi10Xin1mLdiPBS).
0,5mLdiPBSsenzaformaldeide,seipreparatidevonoessereanalizzatientro2ore.
N.B.:Inognicaso,conservareipreparatiaunatemperaturacompresatrai2egli8°Cealriparodallaluce.
CARATTERISTICHEPROCEDURALI
Idatiprestazionalisiottengonoadottandolaproceduradescrittainprecedenzasucampionicorretticonlineacellulareentro24oredalprelievovenoso
previamenteraccoltoinprovettesteriliconanticoagulanteEDTAeconservatoa18–25°C.L’analisivieneeseguitaentro24oredall’immunocolorazione.

B77267–AC13of76
SPECIFICITÀ
CD103(αEβ7)appartieneallemolecoledellafamigliadiintegrina.Sitrattadiuneterodimerocompostodaunasub-unitàαEeunasub-unitàβ7.CD103è
presenteinformamaturascissoinduecatenelegatedapontidisolfuro(catenaC-terminaleda150kDaecatenaN-terminaleda25kDa).L’eterodimerizazione
diCD103conlasub-unitàbeta7dell’integrinacomportalaformazionediintegrinaalfaE/beta7(antigenedeilinfocitidellamucosa1).IlcomplessoαEβ7èun
ligandoperE-caderina(chesiesprimesoprattuttonellecelluleepiteliali)eun’interazionetraαEβ7eE-caderinacomportal’adesionedeilinfocitiallecellule
epiteliali.CD103chesilegaall’E-caderinamedialospostamentodeilinfocitiinposizioneinizialeversol’epiteliointestinalee,inaggiuntaalruolodiadesione,
potrebbefungeredamolecolaaccessoriaperl’attivazionedeilinfocitiintraepiteliali.
L’anticorpomonoclonale2G5(mAb)coloratuttiivarisottogruppideilinfocitiintraepiteliali(IEL)umani,nonchélesottopopolazionidicelluleTdellalamina
propriaedeilinfoblastimesenterici.Reagisceancheconalcunilinfocitiinaltremucose(9,10).
2G5mAbèstatoassegnatoalclusterCD103didifferenziazioneduranteil5thInternationalWorkshoponHumanLeucocyteDifferentiationAntigens(5°
workshopinternazionalesugliantigenididifferenziazionedeileucocitiumani),tenutosiaBoston,StatiUniti,nel1993(codiceWS:A005)(11).
LIMITEDIRILEVAMENTO
LIMITEDIRILEVAZIONECONVERSALYSE
ÈstatoeffettuatounostudioinconformitàalCLSIEP17-A2,(EvaluationofDetectionCapabilityforClinicalLaboratoryMeasurementProcedures;Approved
Guideline-secondEdition(12).Illimitedirilevamento(LOD)èlapiùbassaconcentrazionedianalitachepuòesserecostantementerilevata.Irisultatiottenuti
sonoriepilogatinellaseguentetabella:
TargetpositivoLimitedirilevamento
Molt16+CD103-FITC+1,0cell/μL
PRECISIONE
PRECISIONECONVERSALYSE
Lapercentualedicolorazionediuntargetpositivoèstatodeterminatoutilizzandoduecampionidisangueintero,eseguitoindiecireplicati,lostessogiorno
econlostessocitometro.
Nellaseguentetabellasonoriportatiirisultati:
Media(%)SDCV(%)
TargetpositivoNumero
Donatore1Donatore2Donatore1Donatore2Donatore1Donatore2
Molt16+CD103-FITC+10100,00100,000,010,010,010,01
LIMITAZIONI
1.Irisultatidelleanalisiincitometriaaussopotrebberorivelarsierratiqualoranonsifosseprovvedutoalperfettoallineamentodelcitometro,allacorretta
compensazionedelleuorescenzeealprecisoposizionamentodelleregionidaanalizzare.
2.Èpreferibileutilizzareunatecnicadilisideglieritrociticonlavaggioperchéilreagentenonèstatoottimizzatoperlecosiddettetecnichedilisi“senza
lavaggio”.
3.Siotterrannorisultatiprecisieriproducibiliacondizionecheleprocedureapplicatesianoconformialleistruzioniriportatenelleschedetecnichee
compatibiliconlebuonepratichedilaboratorio.
4.L’anticorpoconiugatodiquestoreagenteècalibratoinmodotaledaoffrireilmigliorrapportosegnalespecico/segnalenonspecico.Èdunque
importantemantenereperognitestilrapportovolumedelreagente/volumedelcampione.
5.Incasodiiperleucocitosi,diluireilsangueinPBSnoadottenereunvaloredicirca5x109leucociti/L(13).
6.Inalcunistatipatologici,comeadesempioinsufcienzarenalegraveoemoglobinopatie,lalisideglieritrocitipuòesserelenta,incompletaopersino
impossibile.Intalcaso,èconsigliabileisolarelecellulemononucleatemediantegradientedidensità(adesempio,Ficoll)primadellacolorazione(14).
MARCHICOMMERCIALI
BeckmanCoulter,illogostilizzatoedimarchicommercialideiprodottieservizidiBeckmanCoultermenzionatiqui,sonomarchicommercialiomarchi
commercialiregistratidiBeckmanCoulter,Inc.,negliStatiUnitieinaltripaesi.
Elencodescrizionisimboli
IlGlossariodeisimbolièdisponibileall’indirizzobeckman.com/techdocs(documentonumeroB60062)

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Especicaciones
EspecicidadCD103
Clon2G5
HibridomaNS1xbalb/c
InmunógenoHumanintestinallymphocytes(HML1)
InmunoglobulinaIgG2a
EspecieRatón
PuricaciónCromatografíadeanidad
FluorocromoFluoresceinisothiocyanate(FITC)
relaciFITC/Ig:5,0-7,0
λdeexcitación488nm
Picodeemisión525nm
TampónPBSpH7,2alqueseleadicionan2mg/mLdeBSAy0,1%NaN3
IOT est
ConjugatedAntibody
CD103-FITC
B49222100tests;2mL,20µL/
determinación
Parausodiagnósticoinvitro.
INDICACIONES
EsteanticuerpoconjugadoconuorocromopermitelaidenticacióndelaspoblacionescelularesqueexpresanelantígenoCD103presenteensangre
periféricahumanaatravésdecitometríadeujo.
PRINCIPIO
Estadeterminaciónsebasaenlacapacidaddelosanticuerposmonoclonalesespecícosdeunirseacélulasleucocitariasmediantelosdeterminantes
antigénicosqueéstasexpresan.
ElmarcajeespecícodelosleucocitosserealizaincubandolamuestraconelreactivoIOTest.Loseritrocitossoneliminadosacontinuaciónporlisis,ylos
leucocitos,noafectadosporestaetapa,sonanalizadosporcitometríadeujo.
Elcitómetrodeujomideladispersióndelaluzylauorescenciadelascélulas.Permiteacotarlapoblacióndeinterésdentrodeunaventanaelectrónica,
denidaenunhistogramaquecorrelacionaladispersiónlateraldeluz("SideScatter"oSS)conladispersiónfrontaldeluz(“ForwardScatter”oFS).
Tambiénpuedenutilizarsecomoapoyoparalafasedecreacióndeunaventanaelectrónicaotroshistogramasquecombinendosdelosdistintosparámetros
disponiblesenelcitómetroenfuncióndelaaplicaciónelegidaporelusuario.
EJEMPLOSDEAPLICACIONESCLÍNICAS
CD103seexpresaenvariossubconjuntosdelinfocitos,incluidounpequeñosubconjuntodelinfocitosperiféricos(célulasTreguladoras),enlinfocitos
estimuladosmedianteTGF-β,enlinfocitosintraepitelialesintestinales,linfocitosdelaláminapropria,célulasdendríticasepitelialesycélulasdendríticas
derivadasdelaláminapropria.LascélulasdendríticasCD103⁺queseencuentranenlalaminapropriadelamucosaintestinalparecendesempeñar
unafunciónimportanteenelmantenimientodelahomeostasisinmunitariaintestinal,queinducerespuestasinmunitariastolerogénicasymarcacambios
fenotípicosencélulasTespecícasdelantígeno.
LascélulasdentríticasqueexpresanelCD103enelintestinoinducencélulasTreguladorasFoxp3apartirdecélulasTFoxp3-CD4conácidoretinoicoy
TGF-βendógeno(1,2).Además,sehadescritoqueunapoblacióndecélulasTCD8+CD103+tienefuncionescelularesefectorasyreguladorasdecélulasT
queparticipancomoeferenteenelrechazodealoinjertoycomosupresordelacitotoxicidadolaproliferación,respectivamente(3,4).CD103estáincluidoen
elpaneldistintivoparalacaracterizacióninmunofenotípicadelaleucemiadecélulaspilosas,queincluyeCD11c+,CD25+,CD20+CD22+debrilloanormal,
CD103+positivo,CD123+asociadosaCD5−,CD10−yCD23−negativos(5,6,7,8).
REACTIVOS
Concentración:verelcerticadodeanálisisespecícodelloteenwww.beckmancoulter.com.
ADVERTENCIASYPRECAUCIONES
1.Noutilizarelreactivodespuésdelafechadecaducidad.
2.Nocongelar.
3.Esperaraqueestéalatemperaturaambiente(18–25°C)antesdeutilizarlo.
4.Minimizareltiempodeexposiciónalaluz.
5.Lacontaminaciónmicrobianadelosreactivospuedegenerarresultadoserróneos.
6.Lassolucionesdeanticuerposquecontienenazidasódica(NaN3)debenmanipularseconprecaución.Noloingierayevitecualquiercontactoconla
piel,lasmucosasylosojos.
Porotraparte,enmedioácido,laazidasódicapuedeformarácidohidrazoico,queespotencialmentepeligroso.Siesnecesarioeliminarelreactivo,
serecomiendadiluirloenungranvolumendeaguaantesdeverterloenlascanalizaciones,paraevitarlaacumulacióndeazidasódicaenlastuberías
metálicasyelconsiguienteriesgodeexplosión.
7.Todamuestradesangredebeconsiderarsecomopotencialmenteinfecciosaymanipularseconlasprecaucionesdeuso(enparticular;utilizaciónde
guantes,bataygafasprotectoras).
8.Nopipetearnuncaconlabocayevitartodocontactodelasmuestrasconlapiel,lasmucosasylosojos.
9.Lostubosdesangreyelmaterialdesechablequesehayanempleadodurantelamanipulacióndebendesecharseencontenedoresespecícospara
laincineración.
10.Losreactivosydesechosdebeneliminarsesegúnlosrequisitoslocales

B77267–AC15of76
CLASIFICACIÓNDEMATERIALPELIGROSOSEGÚNELSGA
Noclasicadocomotóxico
Lahojadedatosdeseguridadestádisponible
enbeckman.com/techdocs
ALMACENAMIENTOYESTABILIDAD
Losconjugadosenformalíquidadebenconservarseentre2y8°Cenunlugarprotegidodelaluz,antesydespuésdeabrirelfrasco.
Estabilidaddelfrascocerrado:véaselafechadecaducidaddelreactivoindicadaenelfrasco.
Estabilidaddelfrascoabierto:elreactivoesestabledurante180días.
MUESTRAS
LasmuestrasdesangrevenosadebenrecogerseentubosestérilesquecontenganunasaldeEDTAcomoanticoagulante.
Lasmuestrasseconservanatemperaturaambiente(18–25º)sinagitación.Antesdeefectuarelanálisisdelamuestra,serecomiendahomogeneizarla
medianteagitaciónsuave.
Lasmuestrasdebenanalizarseenlas24horassiguientesasuobtención.
SIGNOSDEDETERIORO
Cualquiercambioenlaaparienciafísicadelosreactivospuedeindicardeterioro.Entalcaso,elreactivonodebeutilizarse.
Encasodedeteriorodelpaqueteosilosdatosobtenidosindicanunaalteracióndelrendimiento,póngaseencontactoconsudistribuidorlocaloescribaa
lasiguientedireccióndecorreoelectrónico:
CONTENIDOS
Elconservanteazidasódicapuedeformarcompuestosexplosivosenlastuberíasmetálicasdedesagüe.ConsulteelNIOSHBulletin:ExplosiveAzide
Hazard(BoletíndeNIOSH:Peligrodeexplosiónconlaazida)(16/08/1976).
Paraevitarlaposibleacumulacióndecompuestosdeazida,limpieconagualostubosdedesagüetraslaeliminacióndelreactivosindiluir.Paradesechar
laazidasódicadebenseguirselasnormativaslocalesadecuadas.
MATERIALESNECESARIOSPERONOSUMINISTRADOS:
•Tubosderecogidademuestraymaterialnecesarioparaelprocesamientodelasmuestras.
•Pipetasautomáticasconpuntasdesechablespara20,100y500µL.
•Tubosdehemólisisdeplástico.
•MicroesferasdecalibraciónFlow-SetProFluorospheres(Ref.A63492)Flow-CheckProFluorospheres(Ref.A63493)
•Reactivodelisisdeloseritrocitosconetapadelavadotraslisis.Porejemplo:VersaLyse(Ref.A09777).
•Reactivodejacióndelosleucocitos.Porejemplo:SolucióndeFijaciónIOTest3
•ControlisotípicoFITC:reactivoIOTest(Ref.A12689).
•Tampón(PBS:fosfatosódico0,01M;clorurosódico0,145M;pH7,2).
•Centrífuga.
•Mezcladorautomático(TipoVórtex).
•Citómetrodeujo.
PROCEDIMIENTO
ProcedimientoconelreactivoVersaLyse
Paracadamuestraanalizada,ademásdeltubodeensayoserecomiendautilizaruntubodecontrolenlosquelascélulassemezclanenpresenciadelos
controlesisotípicos(Ref.A12689).
1.Añada20µLdeanticuerpoconjugadoIOTestespecícoacadatubodeensayoy20µLdelcontrolisotípicoacadatubodecontrol.
2.Añada100µLdelamuestradeanálisisalosdostubos.Agitesuavementelostubosconvórtex.
3.Incubar15a20minutosatemperaturaambiente(18–25°C)yenunlugarprotegidodelaluz.
4.Acontinuaciónrealicelalisisdeloshematíessegúnlasrecomendacionesdelreactivodelisisutilizado.
Porejemplo,sisedeseautilizarVersaLyse(Ref.A09777),consultarlachatécnicayseguirpreferentementeelprocedimientodenominado“con
jaciónconcomitante”queconsisteenañadir1mLdelamezcla“Fix-and-Lyse”preparadaextemporáneamente.MezclarseguidamenteenelVórtex
duranteunsegundoeincubar10minutosatemperaturaambienteyenunlugarprotegidodelaluz.
5.Centrifugar5minutosa150xgyatemperaturaambiente.
6.Eliminarelsobrenadanteporaspiración.
7.Resuspenderelbotóncelularen3mLdePBS.
8.Repetirlaetapa5.
9.Eliminarelsobrenadanteporaspiraciónyresuspenderelbotóncelularen:
0,5mLdePBSmás0,1%deformaldehídosilaspreparacionesdebenmantenersemenosde24horas.(ParaobtenerunPBScon0,1%de
formaldehído,diluya12,5µLdelasolucióndejaciónIOTest3(Ref.A07800)asuconcentración10Xen1mLdeBS).
0,5mLdePBSsinformaldehído,silaspreparacionesvanaanalizarseenmenosde2horas.
Advertencia:Conservarlaspreparacionesentre2–8°Cenunlugarprotegidodelaluz
RENDIMIENTO

B77267–AC16of76
Losdatosderendimientoseobtienenatravésdelprocedimientodescritoanteriormenteenmuestrasenriquecidasconestirpecelularenunperiodode24
horastraslavenopunción,recogidaspreviamenteentubosdemuestraestérilesconanticoagulantedesaldeEDTAyalmacenadasa18-25°C.Elanálisis
serealizaenunperiodode24horastraslainmunotinción.
ESPECIFICIDAD
CD103(αEβ7)pertenecealasmoléculasdelafamiliadelasintegrinas.SetratadeunheterodímeroqueconstadeunasubunidadαEyunasubunidad
β7.CD103,enformamadura,estádivididoendoscadenasligadaspordisulfuro(cadenade150kDadelextremoCycadenade25kDadelextremoN).
LaheterodimerizacióndeCD103conlasubunidaddeintegrinaβ7producelaformacióndelaintegrinaαE/β7(antígeno1delinfocitosdelamucosa).El
complejoαEβ7esunligandoparaE-cadherina(queseexpresaprincipalmenteenlascélulasepiteliales)yunainteracciónentreαEβ7yE-cadherinada
lugaralaadhesióndelinfocitosalascélulasepiteliales.LaunióndeCD103aE-cadherinaintervieneenlamigracióndirigidadeloslinfocitoshaciaelepitelio
intestinaly,ademásdesufunciónenlaadhesión,puedeservircomomoléculacomplementariaparalaactivacióndelinfocitosintraepiteliales.
Elanticuerpomonoclonal(mAb)2G5tiñelosdiversossubconjuntosdelinfocitosintraepiteliales(LIE)humanos,asícomosubpoblacionesdelinfoblastos
mesentéricosycélulasTdelalaminapropria.Tambiénreaccionaconalgunoslinfocitosdeotrasmucosas(9,10).
Seasignóel2G5mAbalgrupodediferenciaciónCD103duranteel5thInternationalWorkshoponHumanLeucocyteDifferentiationAntigens(5.ºTaller
internacionalsobrelosantígenosdediferenciacióndelosleucocitoshumanos),celebradoenBoston,EE.UU.,en1993(códigoWS:A005)(11).
LÍMITEDEDETECCIÓN
LÍMITEDEDETECCIÓNCONVERSALYSE
ElestudioserealizódeconformidadconCLSIEP17-A2(EvaluationofDetectionCapabilityforClinicalLaboratoryMeasurementProcedures;Approved
Guideline-secondEdition(12).Ellímitededetección(LOD)eslaconcentraciónmásbajadeanalitoquepuededetectarsesistemáticamente.Losresultados
obtenidosseresumenenlatablasiguiente:
BlancopositivoLímitededetección
Molt16+CD103-FITC+1,0cell/μL
PRECISIÓN
PRECISIÓNCONVERSALYSE
Elporcentajedetincióndeunamuestrapositivasedeterminócondosmuestrasdesangrecompletaprocesadaendiezrepeticioneselmismodíayutilizando
elmismocitómetro.
Losresultadosobtenidosseagrupanenlasiguientetabla:
Media(%)DECV(%)
BlancopositivoNúmero
Donante1Donante2Donante1Donante2Donante1Donante2
Molt16+CD103-FITC+10100,00100,000,010,010,010,01
LIMITACIONES
1.Losresultadosdecitometríadeujopuedensererróneossielcitómetronosealineaperfectamente,lasuorescenciasnosecompensan
correctamenteylasventanasdeselecciónnoseajustancuidadosamente.
2.Utilizarpreferentementeunatécnicadelisisdeloseritrocitosconlavado,yaqueestereactivonohasidooptimizadoparalastécnicasdelisis
denominadas"sinlavado".
3.Losresultadosseránprecisosyreproduciblesenlamedidaenquelosprocedimientosutilizadossiganlasinstruccionesdelaschastécnicasysean
compatiblesconlasbuenasprácticasdelaboratorio.
4.Elanticuerpoconjugadodeestereactivoestácalibradoparaofrecerunarelaciónseñalespecíca/señalinespecícaóptima.Porello,esimportante
respetarlaproporciónentreelvolumendereactivoyelvolumendemuestraencadadeterminación.
5.Enelcasodelahiperleucocitosis,diluyalasangreenPBSparaobtenerunvalordeaproximadamente.5x109leucocitos/L(13).
6.Enalgunosestadosdeenfermedad,porejemploconinsucienciarenalohemoglobinopatías,lalisisdeloshematíespuedeserlenta,incompletao
inclusoimposible.Enestecaso,serecomiendaaislarlascélulasmononuclearesutilizandoungradientededensidad(Ficoll,porejemplo)antesde
latinción(14).
MARCASCOMERCIALES
BeckmanCoulter,ellogotipoestilizadoylasmarcasdeproductosyserviciosdeBeckmanCoulteraquímencionadassonmarcascomercialesomarcas
comercialesregistradasdeBeckmanCoulter,Inc.enEstadosUnidosyotrospaíses.
Listadesímbolos
Elglosariodesímbolosestádisponibleenbeckman.com/techdocs(númerodedocumentoB60062)

B77267–AC17of76
Especicações
EspecicidadeCD103
Clone2G5
HibridomaNS1xbalb/c
ImunogénioHumanintestinallymphocytes(HML1)
ImunoglobulinaIgG2a
EspécieRato
PuricaçãoCromatograadeanidade
FluorocromoFluoresceinisothiocyanate(FITC)
RazãomolarFITC/Ig:5,0-7,0
λexcitação488nm
PicodaEmissão525nm
TampãoPBSpH7.2mais2mg/mLBSAe0,1%NaN3
IOT est
ConjugatedAntibody
CD103-FITC
B49222100tests;2mL,20µL/teste
Paransdediagnósticoinvitro.
UTILIZAÇÃOPREVISTA
EsteanticorpoconjugadodeuorocromopermiteaidenticaçãodaspopulaçõesdecélulasquetransmitemoCD103antigéniopresentenosangueperiférico
humanoutilizandoocitometriadeuxo.
PRINCÍPIO
Estetestebaseia-senacapacidadequetêmosanticorposmonoclonaisespecícosparaunir-seaosantigéniosdeterminantesexpressadosporleucócitos.
AcoloraçãoespecícadosleucócitosérealizadaincubandoaamostracomoreagenteIOT est.Osglóbulosvermelhossão,destemodo,removidosporlise
eosleucócitos,osquaisnãosãoafectadosporesteprocedimento,sãoanalisadosporcitometriadeuxo.
Ocitómetromedeadifusãodeluzeauorescênciadascélulas.Possibilitaadelimitaçãodapopulaçãodeinteressenajanelaelectronicadenidapelo
histograma,aqualcorrelacionaadifusãoortogonaldaluz(SideScatterouSS)eadifusãodumestreitoângulodeluz(ForwardScatterouFS).Outros
histogramasquejuntamdoisdosdiferentesparâmetrosdisponíveisnocitómetropodemtambémserusadoscomoajudadependendodaaplicaçãoescolhida
peloutilizador.
EXEMPLOSDEAPLICAÇÕESCLÍNICAS
OCD103éexpressoemváriossubgruposdelinfócitos,incluindoumpequenosubgrupodelinfócitosperiféricos(célulasTreguladoras),emlinfócitos
ativadoselinfócitosestimuladosporTGF-beta,emlinfócitosintestinaisintraepiteliais,emlinfócitosdalâminaprópria,emcélulasdendríticasepiteliaise
célulasdendríticasderivadasdalâminaprópria.AscélulasdendríticasCD103⁺dalâminaprópriadamucosaintestinalparecemdesempenharumpapel
importantenamanutençãodahomeostasiaimunitáriaintestinalinduzindorespostastolerogénicasimunesemarcandoalteraçõesfenotípicasemcélulasT
especícasdeantigénios.
AscélulasdendríticasqueexpressamoCD103nointestinoinduzemreguladoresTFoxp3apartirdecélulasTFoxp3-CD4comácidoendógenoTGF-β
eácidoretinoico(1,2).Alémdisso,foiidenticadaumapopulaçãodecélulasTCD8+CD103+comfunçõesdecélulasefetorasecélulasTreguladoras,
funcionandocomoeferentenarejeiçãodoaloenxertoecomosupressoradecitotoxicidade/proliferação,respetivamente(3,4).OCD103estáincluídono
paineldistintivodecaracterizaçãoimunofenotípicadetricoleucemiasqueincluiCD20+CD22+,CD11c+,CD25+debrilhoanormaleCD103+,CD123+
positivosassociadosaCD5-,CD10-eCD23-negativos(5,6,7,8).
REAGENTES
Concentração:Consulteocerticadodeanáliseespecícadoloteemwww.beckmancoulter.com.
AVISOSEPRECAUÇÕES
1.Nãouseoreagenteapósadatadeexpiração.
2.Nãorefrigere.
3.Deixeatingiratemperaturaambienteantesdeusar(18–25°C).
4.Eviteaexposiçãoàluz.
5.Eviteacontaminaçãomicrobianadosreagentes,podemobter-sefalsosresultados.
6.Assoluçõesdeanticorposcontendoazidasódica(NaN3)devemsermanipuladascomcuidado.Nãoutilizeparausointernoeeviteocontactocoma
pele,mucosaseolhos.Alémdisso,emmeioácido,aazidasódicapodeformaroácidohidrazoicopotencialmenteperigoso.
Paraevitarestapossibilidade,recomenda-sequeoreagentesejadiluídonumgrandevolumedeáguaantesdecoloca-lonosistemadedrenagem
paraevitaraacumulaçãodaazidasódicanostubosdemetaleparapreviroriscodeexplosão.
7.Todasasamostrasdesanguedevemserconsideradascomopotencialmenteinfecciosasedevemsermanipuladascomcuidado(emparticular:uso
deluvas,fatoseóculos).
8.Nuncapipetarcomabocaeevitarqualquercontactodasamostrascomapele,mucosaeolhos.
9.Ostubosdesangueequalquermaterialdescartávelusadonamanipulação,deveserdescartadonumfrascoespecialfechadoparaincineração.
10.Osreagenteseosdesperdíciosdevemsereliminadosdeacordocomosrequisitoslocais.
CLASSIFICAÇÃODEPERIGOGHS
Nãoclassicadocomoperigoso

B77267–AC18of76
AFichadedadosdesegurançaestádisponível
embeckman.com/techdocs
ARMAZENAMENTOEESTABILIDADE
Aformadelíquidosconjugadosdevesermantidaentre2e8°Ceprotegidadaluz,antesedepoisdofrascotersidoaberto.
Estabilidadedofrascofechado:verdatadeexpiraçãodofrasco.
Estabilidadedotuboaberto:Oreagenteéestáveldurante180dias.
AMOSTRAS
Amostrasdesanguedevemsercolhidasutilizandotubosestéreis,contendoumsaldeEDTAcomoanticoagulante.
Asamostrasdevemsermantidasàtemperaturaambiente(18–25°C)enãodevemseragitadas.Asamostrasdevemserhomogeneizadasporagitação
suaveantesdetomaraamostradoensaio.
Asamostrasdevemseranalisadasdentrodas24horasseguintesàcolheita.
EVIDÊNCIADEDEGRADAÇÃO
Qualqueralteraçãonoaspectofísicodosreagentespoderáindicardeterioraçãoeoreagentenãodeveráserutilizado.
Nocasodedeterioraçãodaembalagemouseosdadosobtidosmostraremalgumaalteraçãonodesempenho,contacteodistribuidorlocalouutilizeo
seguinteendereçodee-mail:
ÍNDICE
Aazidasódicautilizadacomoconservantepodeformarcompostosexplosivosemsistemasdecanalizaçõesmetálicas.ConsulteoboletimExplosiveAzide
Hazard(16-8-1976)(Perigosdeexplosãodaazida)doNIOSH(NationalInstituteforOccupationalSafetyandHealth—InstitutoNacionaldeSegurançae
SaúdeOcupacional)norte-americano.
Paraevitarapossívelacumulaçãodecompostosdeazida,enxagueascondutasderesíduoscomáguaapósodescartedoreagentenãodiluído.A
eliminaçãodeazidasódicadeveserefetuadadeacordocomasnormaslocaisapropriadas.
MATERIAISNECESSÁRIOSMASNÃOFORNECIDOSCOMOKIT:
•Tubosdeensaioematerialnecessárioparaamostragem.
•Pipetasautomáticascompontasdescartáveispara20,100e500µL.
•Tubosplásticosdehemólise.
•Esférulasdecalibração:Flow-SetProFluorospheres(Ref.A63492)Flow-CheckProFluorospheres(Ref.A63493).
•Reagentedelisedeglóbulosvermelhoscomfasedelavagemdepoisdalise.Porexemplo:VersaLyse(Ref.A09777).
•Reagentedexaçãodeleucócitos:Porexemplo:SoluçãodeFixaçãoIOTest3(Ref.A07800).
•ControloIsotípicoFITC:reagenteIOTest(Ref.A12689).
•Tampão(PBS:0.01Mfosfatodesódio;0.145Mcloretodesódio;pH7.2).
•Centrífuga.
•Agitadorautomático(tipoVortex).
•Citómetrodeuxo.
PROCEDIMENTO
ProcedimentocomreagenteVersaLyse
Paracadaamostraanalisada,alémdotubodeteste,érecomendadoumtubodecontroloondeascélulassãomisturadasnapresençadocontroloisotópico
(RefªA12689).
1.Adicione20µLdeanticorpoconjugadodeIOTestespecícoemcadatubodetestee20µLdocontroloisotípicoemcadatubodecontrolo.
2.Adicione100µLdaamostradetesteemambosostubos.Efectueaagitaçãodostuboscuidadosamente.
3.Incubepor15a20minutos,àtemperaturaambiente(18–25°C),protegidodaluz.
4.Depois,efectuealisedosglóbulosvermelhos,seguindoasrecomendaçõesdoreagentedeliseutilizado.
Comoexemplo,sedesejautilizarVersaLyse(Ref.A09777),consulteofolhetoesigapreferivelmenteoprocedimentoconhecidopelonome“Com
xaçãoconcomitante“queconsisteemadicionar1mLdamisturade“Fix-and-Lyse”preparadaextemporaneamente,agitarimediatamentenovortex
por1segundoeincubarpor10minutosàtemperaturaambiente,protegidodaluz.
5.Centrifuguedurante5minutosa150xgàtemperaturaambiente.
6.Removaosobrenadanteporaspiração.
7.Ressuspendaopelletcelularcom3mLdePBS.
8.Repitaopasso5.
9.Removaosobrenadanteporaspiraçãoeressuspendaopelletcelularcom:
0,5mLdePBSmais0,1%deformaldeídoseaspreparaçõesforemparasermantidasmenosde24horas.(UmPBSde0,1%deformaldeídopode
serobtidodiluindo12,5µLdaSoluçãoxativaIOTest3(RefªA07800)easuaconcentraçãode10Xem1mLdePBS).
0,5mLdePBSsemformaldeído,seaspreparaçõessedestinaremaseranalisadasnoprazode2horas.
Nota:Emtodososcasos,mantenhaasamostrasentre2e8°Ceprotegidasdaluz.
DESEMPENHO
Osdadosdedesempenhosãoobtidosseguindooprocedimentodescritoanteriormenterelativoàsamostrasmisturadascomlinhascelularesnumprazode
24horasapósapunçãovenosa,previamenterecolhidasemtubosdeamostraestéreiscomsaldeEDTAcomoanticoagulanteearmazenadasa18–25°C.
Aanáliseérealizadanumperíodode24horasapósaimunocoloração.

B77267–AC19of76
ESPECIFICIDADE
OCD103(αEβ7)pertenceàfamíliadasintegrinas.ÉumheterodímerocompostoporumasubunidadeαEeumasubunidadeβ7.OCD103possuiumaforma
maduraedivide-seemduascadeiasligadaspordissulfureto(cadeiade150kDaC-terminalecadeiade25kDaN-terminal).AheterodimerizaçãodoCD103
comasubunidadedeintegrinabeta7conduzàformaçãodaintegrinaalfaE/beta7(antigénio1delinfócitosdamucosa).OcomplexoαEβ7éumligandoda
caderinaE(expressasobretudoemcélulasepiteliais)eumainteraçãoentreoαEβ7eacaderinaEresultanaadesãodoslinfócitosàscélulasepiteliais.A
ligaçãodoCD103àcaderinaEmediaoalojamentodelinfócitosnoepitéliointestinal,e,alémdopapeldesempenhadonaadesão,podefuncionarcomo
moléculaacessórianaativaçãodelinfócitosintraepiteliais.
Oanticorpomonoclonal2G5(mAb)coraosdiversossubgruposdelinfócitosintraepiteliaishumanos(IEL),bemcomoassubpopulaçõesdecélulasTda
lâminaprópriaeoslinfoblastosmesentéricos.Tambémreagecomalgunslinfócitosnoutrasmucosas(9,10).
O2G5mAbfoiatribuídoaoaglomeradodediferenciaçãodoCD103duranteo5thInternationalWorkshoponHumanLeucocyteDifferentiationAntigens(5.º
workshopinternacionalsobreantigéniosdediferenciaçãodeleucócitoshumanos),emBoston,EUA,em1993(CódigoWS:A005)(11).
LIMITEDEDETEÇÃO
LIMITEDEDETEÇÃOCOMVERSALYSE
FoiconduzidoumestudodeacordocomCLSIEP17-A2,(EvaluationofDetectionCapabilityforClinicalLaboratoryMeasurementProcedures;Approved
Guideline-secondEdition(12).OLOD(LimitofDetection-Limitededetecção)éaconcentraçãomaisbaixadeanalitoquepodeserdetectada
consistentemente.Osresultadosobtidossãoresumidosnatabelaseguinte:
AlvopositivoLimitededeteção
Molt16+CD103-FITC+1,0cell/μL
PRECISÃO
PRECISÃOCOMVERSALYSE
Apercentagemdecoloraçãodeumalvopositivofoideterminadautilizandoduasamostrasdesanguecompletas,processadasemdezreplicações,no
mesmodiaeutilizandoomesmocitómetro.
Osresultadosobtidosapresentam-senatabelaseguinte:
Média(%)DPCV(%)
AlvopositivoNúmero
Dador1Dador2Dador1Dador2Dador1Dador2
Molt16+CD103-FITC+10100,00100,000,010,010,010,01
LIMITAÇÕES
1.Acitometriadeuxopodeproduzirfalsosresultadosseocitómetronãoforalinhadoperfeitamente,seoescapedeuorescêncianãoforcorrectamente
compensadoeseasregiõesnãoforemcuidadosamenteposicionadas.
2.Épreferívelutilizaratécnicadelisedosglóbulosvermelhoscomlavagemquandooreagentenãofoioptimizadopelastécnicaslise"semlavagem".
3.Resultadossegurosereprodutíveispoderãoserobtidosnamedidaemqueoprocedimentousadoestejadeacordocomatécnicadescritanofolheto
incluídoesejacompatívelcomasboaspráticasdelaboratório.
4.Oanticorpoconjugadodestereagenteécalibradodemodoaofereceramelhorrazãosinalespecíco/sinalnãoespecíco.Porconseguinte,é
importanteaderiràrazãodevolumedereagente/volumedaamostraemcadateste.
5.Nocasodeumhiperleucocitosis,diluaosangueemPBSdemodoaobterumvalordeaproximadamente5x109leucócitos/L(13).
6.Emcertosestadosdadoença,comofalharenalgraveouhemoglobinopatias,alisedosglóbulosvermelhospodeserlenta,incompletaoumesmo
impossível.Nestecaso,érecomendadooisolamentodascélulasmononucleadasutilizandoumgradientededensidade(Ficoll,porexemplo)antes
dacoloração(14).
MARCASCOMERCIAIS
BeckmanCoulter,ologótipoestilizadoeasmarcasdeprodutoseserviçossupramencionadosdaBeckmanCoultersãomarcascomerciaisoumarcas
comerciaisregistadasdaBeckmanCoulter,Inc.nosEstadosUnidoseoutrospaíses.
Legendadossímbolos
OGlossáriodesímbolosestádisponívelembeckman.com/techdocs(númerododocumentoB60062).

B77267–AC20of76
Specikationer
SpecicitetCD103
Klon2G5
HybridomNS1xbalb/c
ImmunogenHumanintestinallymphocytes(HML1)
ImmunoglobulinIgG2a
ArtMus
OprensningAfnitets-kromatogra
FluorokromFluoresceinisothiocyanate(FITC)
MolærforholdFITC/Ig:5,0-7,0
λ-excitation488nm
Emissionstop525nm
BufferPBSpH7,2plus2mg/mLBSAog0,1%NaN3
IOT est
ConjugatedAntibody
CD103-FITC
B49222100tests;2mL,20µL/test
Tilinvitrodiagnostiskbrug.
TILSIGTETBRUG
Detteuorokrom-konjugeredeantistofgivermulighedforatidenticerecellepopulationer,somudtrykkerdetCD103antigen,derforekommerihumantperifert
blodvedhjælpafowcytometri.
PRINCIP
Dennetesterbaseretpåspecikkemonoklonaleantistoffersevnetilatbindetilantigendeterminanter,dererudtryktafleukocytter.
SpecikfarvningafleukocytterneudføresvedinkubationafprøvenmedIOTest-reagenset.Erytrocytternefjernesdereftervedlysering,ogleukocytterne,
somikkepåvirkesafdenneproces,analyseresvedowcytometri.
Flowcytometretmålerlysdiffusionogcellernesuorescens.Dettegørdetmuligtafafgrænsedeninteresantepopulationindenforetelektroniskvindue
deneretpåethistogram,somkorrelererdenorthogonalelysdiffusion(SideScatterellerSS)diffusionenafsnævervinkletlys(ForwardScatterellerFS).
Andrehistogrammer,derkombinerertoafdeforskelligeparametretilgængeligepåcytometret,kananvendessomhjælpigating-stadietafhængigtafdenaf
brugerenvalgteapplikation.
EKSEMPLERPÅKLINISKEANVENDELSER
CD103udtrykkesiereundersætaflymfocytter,herunderetlilleundersætafperiferelymfocytter(T-reguleringsceller),påaktiveredeogTGF-betastimulerede
lymfocytter,påintraepitheliallymfocytteritarmen,laminapropria-lymfocytter,epitelialedendritiskecelleroglaminapropria-aedtedendritiskeceller.
CD103⁺dendritiskecelleritarmslimhindeslaminapropriasynesatspilleenvigtigrolleiatbevaretarmensimmunehomøostase,derinducerertolerogene
immunreaktionerogprægerfænotypiskeændringerpåantigenspecikkeT-celler.
Dendritiskeceller,derudtrykkerCD103itarmen,inducererFoxp3T-reguleringscellerfraFoxp3-CD4-T-cellermedendogenTGF-βogretinsyre(1,2).
LigeledeserenpopulationafCD8+CD103+T-cellerblevetbeskrevetmedeffektor-ogT-reguleringscellefunktioner,derdeltagersomefferenteiallograft
afstødningenogundertrykkelsenafhenholdsviscytotoksicitet/proliferation(3,4).CD103erinkluderetipanelet,dererkarakteristiskforimmunfænotypisk
karakteriseringafhårcelleleukæmi,deromfatterunormaltlyseCD20+CD22+,CD11c+,CD25+,positivCD103+,CD123+forbundetmednegativCD5-,
CD10-ogCD23-(5,6,7,8).
REAGENSER
Koncentration:Separtispeciktanalysecertikatpåwww.beckmancoulter.com.
ADVARSLEROGFORHOLDSREGLER
1.Anvendikkereagensetefterudløbsdatoen.
2.Måikkefryses.
3.Bringreagensettilstuetemperatur(18–25°C)indenbrug.
4.Minimereksponeringmodlys.
5.Undgåmikrobielkontamineringafreagenset,daderisåfaldkanopståfejlagtigeresultater.
6.Antistofopløsninger,derindeholdernatriumazid(NaN3),skalhåndteresmedforsigtighed.Måikkeindtages.Undgåkontaktmedhud,slimhinderog
øjne.
Endviderekannatriumazidisureomgivelserdannepotentieltfarligthydrogenazid.Vedbortskaffelseanbefalesdet,atreagensetfortyndesietstort
volumenvand,indendethældesiaøbet,foratundgåophobningerafnatriumazidimetalrørogforatforebyggeeksplosionsrisiko.
7.Alleblodprøverskalbetragtessompotentieltsmittefarligeogskalhåndteresmedforsigtighed(navnlig:bærhandsker,kittelogbeskyttelsesbriller).
8.Pipettéraldrigmedmundenogundgå,atprøvernekommerikontaktmedhud,slimhinderogøjne.
9.Prøverørmedblodogengangsmaterialeranvendtunderhåndteringenskalbortskaffesisærligebeholdereberegnettilaffaldsforbrænding.
10.Reagenserogaffaldskalelimineresihenholdtildelokalekrav.
GHSFAREKLASSIFIKATION
Ikkeklassiceretsomfarlig.
Sikkerhedsdatabladndespåbeckman.com/techdocs