Agilent Technologies ZORBAX Series User manual

for Agilent
Reversed-Phase Columns
COLUMN USER GUIDE
Agilent 反相色谱柱用户指南
Guide d’utilisation des colonnes pour les colonnes à
phase inverse Agilent
Säulenbenutzerhandbuch für Agilent
Umkehrphasensäulen
Manuale utenti per colonne a fase inversa Agilent
Guía de usuario de columna para columnas de fase
reversa Agilent
Agilent 逆相カラム ユーザーガイド
ZORBAX reversed-phase / 反相 / à phase reversa / Umkehrphase /
Fase inversa / Fase inversa / 逆相
HPLC phases / 相/ Phases HPLC / Phasen / Fasi / Fases /カラム
InfinityLab Poroshell 120 / Pursuit / Polaris / HC-C18(2) / TC-C18(2)

This booklet provides general information
for all InfinityLab Poroshell 120,
ZORBAX, Pursuit and Polaris columns.
For additional detailed information
about your specific phase or family, see:
www.agilent.com/chem/columnchoices
Getting Started
A QC Column Performance Report, including a test chromatogram, is
enclosed with every Agilent column. The QC test system has been modified
from a standard system to minimize system dead volume, so it may vary
from the system used in your lab. This allows a better evaluation of the
column and assures a more consistent product. A properly configured
LC system will generate similar results to the chromatogram on your QC
Performance Report.
Modern columns are robust and are designed to operate for long periods
under normal chromatographic conditions. You can maximize column
performance by running it within specifications. Always review the
specifications before putting in place a final method.

Using Your Column
Installation
• The direction of flow is marked on the column.
• 1.8 µm columns (ZORBAX RRHT, ZORBAX RRHD) can only be operated in the
direction flow marked on the column.
• Agilent recommends InfinityLab Quick Connect fittings (5067-5961 for 0.075 x
105 mm) or Quick Turn fittings (5067-5966) for a perfect column connection,
every time. Polyketone fittings (5042-8957) can also be used for columns up to
600 bar
Column conditioning
Every column is tested before shipment and shipped in the test eluent. So, for first
use, rinsing with water is not necessary. If mobile phase additives are used (such as
buffers or ion-pair reagents) it is advisable to do an intermediate flush with a mobile
phase of the correct composition, but without these additions. Flushing with 10 to 20
column volumes should help in transitioning to your mobile phase. For shorter chain
chemistries (C8, Phenyl, CN, for example), care should be taken to make sure the
column has been properly equilibrated prior to use. This will ensure reproducibility
and help prevent retention time drifting.
Important safety considerations
• All points of connection in liquid chromatographic systems are potential sources
of leaks. Users should be aware of the toxicity or flammability of their mobile
phases.
• Because of the small particle size, dry column packings are respirable. Columns
should only be opened in a well-ventilated area.
• Please adhere to operating pressure limits noted for each column (see chart).
Exceeding these limits will compromise chromatographic performance and could
be unsafe.
ENGLISH
Search Agilent.com for “quick connect fitting” to learn more
Polyketone fitting,
p/n 5042-8957
Agilent 1200 bar removable
fitting, p/n 5067-4733
Agilent Quick Connect fitting,
p/n 5067-5961

Other operating tips
• While generally not harmful to the column, reverse flow should be
avoided except to attempt removal of clogged frit (see “column care”).
• Always use high purity reagents and chromatography grade solvent
to prepare your mobile phase. Degas and filter all mobile phase prior
to use.
• Disassembling a column will degrade column performance.
• New columns contain a mixture of organic solvents and water. See
your QC Performance Report for the solvent composition in your
column. Initially, care should be taken not to pass any mobile phase
through the column that may cause a precipitate to form.
• Agilent reversed-phase columns are compatible with water and all
common organic solvents.
• The use of a guard column is recommended to protect your column
and increase its lifetime.
• Columns should not be maintained at elevated pH or elevated
temperature when not in use.
• Avoid use of this column outside of recommended pH ranges for
column phase (see next page). Expect reduced lifetime when operating
outside the recommended pH and temperature ranges.
If you are using InfinityLab Poroshell 120 or ZORBAX RRHT or RRHD
columns, use a Fast Guard for UHPLC to protect your analytical
column.
See www.agilent.com/chem/fastguards for more information.

Column Operating Parameters: pH and Temperature
Phase Recommended
pH range
Maximum operating
temperature
InfinityLab Poroshell 120 EC-C18,
EC-C8 and Bonus-RP.
ZORBAX Eclipse Plus C18 and C8.
ZORBAX Eclipse XDB-C18,
XDB-C8 and XDB-Phenyl ZORBAX
Bonus-RP.
HC-C18(2) and TC-C18(2).
pH 2.0 to 9.0 60 °C
InfinityLab Poroshell 120 PFP and
Phenyl-Hexyl.
ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl.
ZORBAX XDB-CN.
ZORBAX Eclipse PAH.
ZORBAX ODS and Phenyl.
All Pursuit, Polaris, Microsorb,
Metasil, Monochrom, Hypersil,
OmniSpher, MicroSpher bonded
phases.
pH 2.0 to 8.0 60 °C
ZORBAX Eclipse PAH pH 2.0 to 8.0 60 °C at pH <6.0
ZORBAX TMS pH 2.0 to 7.0 60 °C
InfinityLab Poroshell 120 SB-C18,
SB-C8 and SB-Aq.
ZORBAX StableBond SB-C18, SB-
C8, SB-Aq, SB-C3 and SB-Phenyl
ZORBAX Rx-C8.
pH 1.0 to 8.0 90 °C (StableBond C18
and Poroshell 120 SB-C18)
80 °C (Rx-C8 and SB-Aq,
SB-C3 and SB-Phenyl)
InfinityLab Poroshell HPH-C18 and
HPH-C8
pH 3.0 to 11.0 60 °C
ZORBAX Extend C18 pH 2.0 to 11.5 60 °C (40 °C at high pH)
Note: All silica-based packings have some solubility in pH >6 aqueous mobile
phases. When using silica-based columns at pH >6, best column lifetime is
obtained at lower temperatures (40 °C max) using low buffer concentrations in the
range of 0.01 to 0.02 M. Operating at extreme ends of pH and temperature ranges
will have a significant impact on column lifetime.
ENGLISH

Maximum Operating Pressures –
Columns up to 9.4 mm id
Column type Particle size Pressure limit
InfinityLab Poroshell 120,
InfinityLab Poroshell HPH
1.9 µm 1300 bar
(19500 psi)
InfinityLab Poroshell 120,
InfinityLab Poroshell HPH
2.7 µm, 4 µm 600 bar
(9000 psi)
ZORBAX Rapid Resolution High
Definition (RRHD)
1.8 µm 1300 bar
(19500 psi)
ZORBAX Rapid Resolution High
Throughput (RRHT)
1.8 µm 600 bar
(9000 psi)
All other ZORBAX, Rx, Pursuit,
Polaris, HC, TC, Microsorb,
Metasil, Monochrom, Hypersil,
OmniSpher, MicroSpher
3.0 µm, 3.5 µm,
5 µm, 10 µm
400 bar
(6000 psi)
Mobile Phase Selection and Operating Temperatures
The bonded stationary phase is nonpolar in nature and is best used with
polar mobile phases such as methanol/water or acetonitrile/water
mixtures. Increasing the amount of organic component typically reduces
the retention time of the sample.

Recommended Starting Gradients
Stationary phase Usage notes
Most reversed-phase
columns
5% methanol or acetonitrile initially and 100%
methanol or acetonitrile as the final solvent.
ZORBAX Eclipse PAH* 30 or 40% acetonitrile initially, to 100%
acetonitrile as final solvent. It may be necessary
to cool column to 15 to 20 °C for improved
resolution.
ZORBAX and InfinityLab
Poroshell Bonus-RP
Lower concentration of organic mobile phase
modifier is required for compound elution,
compared to traditional long-chain alkyl
stationary phases.
*Best column lifetime is achieved at < 40 °C.
ENGLISH

Column Care
The inlet frit on columns with a particle size of 2.7 µm or greater has a
nominal porosity of 2 µm. Samples that contain particulate matter will plug
the column inlet frit. Guard columns and hardware kits (as required) are
recommended for use with such samples, and are generally recommended
for all column use.
See www.agilent.com/chem/fastguards for more information about
guard columns.
Cleaning Your Column/Extending Column Life
For columns that can be backflushed (InfinityLab Poroshell 120, ZORBAX
columns with particles >1.8 µm and all Pursuit and Polaris columns), start
with a stronger (less polar) solvent.
1. Disconnect column from detector and run wash solvents into a beaker.
2. Start with your mobile phase without buffer salts (water/organic).
Run at 10 to 20 column volumes through.
3. Next, use 100% organic (methanol or acetonitrile).
4. Check pressure to see if it has returned to normal; if not, then,
5. Discard column or consider stronger conditions,
e.g., 75% acetontrile/25% isopropanol
6. Increase to 100% isopropanol, 100% methylene chloride or 100%
hexane (if you use methylene chloride or hexane, you will need to flush
the column with isopropanol prior to use and before returning to your
reversed-phase mobile phase).
For columns with particles < 1.8 µm, do not backflush the column - replace
the column.

Storage Recommendations
Long-term storage of silica-based, bonded phase columns should be in
a pure organic solvent. If the column has previously been used with a
buffered mobile phase, the buffer should first be removed by purging the
column with 20 to 30 column volumes of a 50:50 mixture of methanol or
acetonitrile and water, followed by 20 to 30 column volumes of the pure
solvent. Before storing, end-fittings should be tightly capped with end-
plugs to prevent packing from drying out. Columns may be safely stored for
short periods in most mobile phases. To protect equipment, is it desirable
to remove salts from the instrument and column by purging the column
with the same mobile phase without the buffer (e.g. using 60:40 ACN/
H20 to remove a 60:40 ACN/0.02 M phosphate buffered mobile phase).
Re-equilibration is rapid with the original mobile phase when using this
approach and any danger of corrosion from the salts is eliminated.
ENGLISH

Tips for Getting the Best Chromatographic Results
• Optimize your instrument by minimizing tubing lengths between
components, to reduce extra column volume and band broadening.
Use 0.12 mm id red or 0.075 mm id black tubing for Fast LC/high
efficiency columns. Learn about capillary options at
www.agilent.com/chem/lccapillaries
• Ensure the data collection rate is optimized for your column. Use a
higher collection rate for Fast LC columns (Poroshell 120, RRHT, RRHD).
• Use sample filtration or other sample prep as appropriate for your
sample. Learn more at www.agilent.com/chem/sampleprep
• Use Agilent certified lamps in your LC instruments for best
performance.

中文
本小册子提供关于 InfinityLab
Poroshell 120、ZORBAX、Pursuit 和
Polaris 色谱柱的一般信息。
有关特定固定相或其产品系列的
详细信息，请访问我们的网站：
www.agilent.com/chem/columnchoices
入门指南
每根安捷伦色谱柱均附有包括测试色谱图在内的 QC 色谱柱
性能报告。QC 测试系统基于标准系统优化而来，可以使系
统死体积降至最低，因此可能与您实验室所用的系统有所不
同。这套系统可以对色谱柱进行更加全面的评估，确保产品
具有更高的一致性。经过适当配置的液相色谱系统可以生成
类似于您的 QC 性能报告中的色谱图结果。
现代色谱柱稳定耐用，可在正常色谱条件下运行较长时间。
在规格指标范围内运行色谱柱可最大程度提高色谱柱性能。
在确定最终方法前，请务必查看规格指标。

色谱柱使用说明
安装
• 色谱柱上标明了液流方向
• 1.8 µm 色谱柱（ZORBAX RRHT、ZORBAX RRHD）只能按照色谱柱上标
明的液流方向使用
• 安捷伦建议使用 InfinityLab Quick Connect 快速连接接头（5067-5961，
用于 0.075 ×105 mm）或 Quick Turn 接头 (5067-5966)，确保您始终获
得完美色谱柱连接。针对耐压达 600 bar 的色谱柱也可使用聚酮接
头(5042-8957)
色谱柱平衡
每根色谱柱在发货前均经过了测试，并保存在测试洗脱液中运输。
因此，首次使用色谱柱时没有必要用水冲洗。如果使用了流动相添
加剂（如缓冲液或离子对试剂），建议用正确组分但不含此类添加剂
的流动相进行过渡冲洗。冲洗 10 到20 倍柱体积有助于过渡到您所要
使用的流动相。对于短链键合相（例如 C8、苯基和氰基），需要谨慎
操作，确保色谱柱在使用前已达到平衡。这样可以保证重现性，并
能防止保留时间漂移。
重要的安全注意事项
• 液相色谱系统中的所有连接点都有可能成为泄漏源。用户应当了
解所使用流动相的毒性或易燃性
• 由于填料粒径较小，因此干燥的柱填料可被吸入体内。只能在通
风良好的区域打开色谱柱
• 请遵循每根色谱柱指明的的运行压力上限（请参见图表）。超出
这些限制会降低色谱性能，并会有安全隐患
在Agilent.com 网页上搜索“Quick Connect 快速连接接头”，
了解更多信息
聚酮接头，
部件号 5042-8957
Agilent 1200 bar
可拆卸接头，
部件号 5067-4733
Agilent Quick Connect
快速连接接头，
部件号 5067-5961

中文
其他运行提示
• 反向使用色谱柱通常不会对其造成危害，但也应该尽量
避免，除非出现需要除去堵塞柱前筛板上颗粒物的情况
（请参见“色谱柱维护”）
• 始终使用高纯度试剂和色谱级溶剂配制流动相。使用前
对所有的流动相进行脱气和过滤
• 拆卸色谱柱会降低其性能
• 新色谱柱含有机溶剂和水的混合物。请参见 QC 性能报
告，了解色谱柱中的溶剂组成。开始使用时，应注意避
免使可能产生沉淀的流动相流过色谱柱
• 安捷伦反相色谱柱可与水和所有常见有机溶剂兼容
• 建议使用保护柱来保护色谱柱并延长后者的使用寿命
• 在不使用色谱柱时，不应将其置于高 pH 值或高温环境中
• 避免在推荐的色谱柱固定相的 pH 范围外使用色谱柱（请
参见下一页）。在推荐的 pH 和温度范围外运行可能会缩
短使用寿命
如果您使用 InfinityLab Poroshell 120 、 ZORBAX RRHT 或 RRHD
色谱柱，请使用 UHPLC 快速保护柱保护您的分析色谱柱。
如需了解更多信息，请访问 www.agilent.com/chem/fast-
guards 。

色谱柱运行参数：pH 和温度
固定相 推荐的
pH 范围
最高运行温度
InfinityLab Poroshell 120 EC-C18、
EC-C8 和Bonus-RP；
ZORBAX Eclipse Plus C18 和C8；
ZORBAX Eclipse XDB-C18、
XDB-C8、XDB-Phenyl 和
ZORBAX Bonus-RP；
HC-C18(2) 和TC-C18(2)；
pH 2.0 到9.0 60 °C
InfinityLab Poroshell 120 PFP 和
Phenyl-Hexyl；
ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl；
ZORBAX XDB-CN；
ZORBAX Eclipse PAH；
ZORBAX ODS 和Phenyl；
所有 Pursuit、Polaris、
Microsorb、Metasil、
Monochrom、Hypersil、
OmniSpher 和MicroSpher
键合相；
pH 2.0 到8.0 60 °C
ZORBAX Eclipse PAH pH 2.0 到8.0 pH 6.0 以下，60 °C
ZORBAX TMS pH 2.0 到7.0 60 °C
InfinityLab Poroshell 120 SB-C18、
SB-C8 和SB-Aq；
ZORBAX StableBond SB-C18、
SB-C8、SB-Aq、SB-C3 和
SB-Phenyl
ZORBAX Rx-C8；
pH 1.0 到8.0 90 °C（StableBond C18 和
Poroshell 120 SB-C18）
80 °C（Rx-C8 和SB-Aq、
SB-C3 和SB-Phenyl）
InfinityLab Poroshell HPH-C18 和
HPH-C8
pH 3.0 到11.0 60 °C
ZORBAX Extend C18 pH 2.0 到11.5 60 °C（高 pH 时40 °C）
注意：所有硅胶基填料在 pH 值大于 6 的水相流动相中都有一定的
溶解度。在 pH 值大于 6 的条件下使用硅胶基色谱柱时，采用较低
柱温（最高 40 °C）和较低缓冲溶液浓度 (0.01-0.02 M) 可获得最长的
使用寿命。在 pH 和温度范围的极端处运行会对色谱柱寿命产生重
大影响。

中文
最大内径 9.4 mm 的色谱柱的最大运行压力
色谱柱类型 粒径 压力上限
InfinityLab Poroshell 120、
InfinityLab Poroshell HPH
1.9 µm 1300 bar
(19500 psi)
InfinityLab Poroshell 120、
InfinityLab Poroshell HPH
2.7 µm、4 µm 600 bar
(9000 psi)
ZORBAX 超高压快速高分离度
(RRHD)
1.8 µm 1300 bar
(19500 psi)
ZORBAX 超高压快速高通量
(RRHT)
1.8 µm 600 bar
(9000 psi)
所有其他 ZORBAX、Rx、
Pursuit、Polaris、HC、TC、
Microsorb、Metasil、
Monochrom、Hypersil、
OmniSpher 和MicroSpher
3.0 µm、3.5 µm、
5 µm 和10 µm
400 bar
(6000 psi)
流动相的选择和运行温度
键合固定相在性质上是非极性的，最好与甲醇/水或乙腈/水
的混合物等极性流动相一起使用。有机成分含量的增加通常
会缩短样品的保留时间。

推荐的初始梯度
固定相 使用说明
大多数反相色谱柱 初始使用 5% 甲醇或乙腈，并使用 100% 甲
醇或乙腈作为最终溶剂。
ZORBAX Eclipse PAH* 初始使用 30% 或40% 乙腈，使用 100% 乙
腈作为最终溶剂。可能需要将色谱柱冷却
至15 到20 °C 以获得更好的分离度。
ZORBAX 和InfinityLab
Poroshell Bonus-RP
与传统长链烷基固定相相比，需要添加低
浓度有机流动相改性剂用于化合物洗脱。
* 低于 40 °C 可实现最佳色谱柱寿命

中文
色谱柱维护
粒径为 2.7 µm 或以上的色谱柱的入口筛板标称孔径通常为
2 µm。含有颗粒物质的样品会堵塞色谱柱入口筛板。分析这
类样品时建议使用保护柱和硬件套件（如有需要），并建议
用于所有色谱柱。
有关保护柱的更多信息，请访问 www.agilent.com/chem/
fastguards。
冲洗色谱柱/延长色谱柱的使用寿命
对于可进行反冲的色谱柱（颗粒大于 1.8 µm 的InfinityLab
Poroshell 120、ZORBAX 色谱柱，以及所有 Pursuit 和Polaris 色谱
柱），从较强（极性较小）溶剂强度开始。
1. 断开色谱柱与检测器的连接，将清洗溶液排入烧杯
2. 先使用不含缓冲盐的流动相（水/有机溶液）。冲洗 10 到
20 倍柱体积
3. 接下来用 100% 有机溶剂（甲醇或乙腈）
4. 检查压力是否已经恢复正常，如果没有，则：
5. 丢弃色谱柱或考虑采用更强的条件，如 75% 乙腈/25% 异
丙醇
6. 选用 100% 异丙醇、100% 二氯甲烷或 100% 己烷（如果您
采用二氯甲烷或己烷，需在使用前以及返回到反相流动
相之前用异丙醇冲洗色谱柱）
对于填料颗粒小于 1.8 µm 的色谱柱，不要反冲色谱柱，应更
换色谱柱。

存放建议
硅胶基、键合相色谱柱应置于纯有机溶剂中进行长期储存。
如果色谱柱之前使用过缓冲流动相，则应该首先采用 20 到
30 倍柱体积的 50:50 甲醇或乙腈与水的混合溶液冲洗色谱
柱，然后使用 20 到30 倍柱体积的纯溶剂对其进行冲洗，以
实现除去缓冲液的目的。储存之前将堵头紧紧密封在柱端接
头上，以免填料变干。色谱柱可以在短时间内安全储存于大
多数流动相中。为了保护仪器，可以采用无缓冲液的相同
流动相冲洗色谱柱以除去仪器和色谱柱中的盐，例如采用
60:40 ACN/H20 除去 60:40 ACN/0.02 M 磷酸盐缓冲液的流动相。
采用这种方法借助原始流动相可以快速达到再平衡，并可以
消除盐腐蚀的危害。

中文
获得最佳色谱结果的注意事项
• 通过最大限度减少组件间的管线长度对仪器进行优化，
以减少柱外体积和峰展宽。对于快速液相/高效色谱柱应
采用 0.12 mm 内径的红色管线或 0.075 mm 内径的黑色管
线。有关毛细管选件的信息，请访问 www.agilent.com/
chem/lccapillaries
• 针对您的色谱柱确保数据采集速率的优化。为快速液相色
谱柱（Poroshell 120、RRHT 和RRHD）选择更高的采集速率
• 采用与您的样品相适应的样品过滤或其他的样品前处
理方法。如需了解更多信息，请访问 www.agilent.com/
chem/sampleprep
• 请在液相色谱仪器中使用安捷伦认证灯以实现最佳性能

Cette brochure contient des informations
générales applicables à toutes les
colonnes InfinityLab Poroshell 120,
ZORBAX, Pursuit et Polaris.
Pour plus d’informations sur votre
phase ou la série de colonnes que vous
possédez, visitez le site :
www.agilent.com/chem/columnchoices
Mise en route
Un rapport CQ sur les performances des colonnes, comprenant un
chromatogramme test, accompagne chaque colonne Agilent. L’instrument
HPLC de test CQ a été modifié (optimisé) par rapport à un instrument
standard afin de minimiser les volumes morts, il peut être différent
du système utilisé dans votre laboratoire. Cela permet une meilleure
évaluation de la colonne et garantit une meilleure conformité du produit.
Un instrument LC correctement configuré génèrera des résultats similaires
au chromatogramme sur votre rapport CQ des performances.
Les colonnes modernes sont particulièrement robustes et sont conçues
pour être utilisées sur de longues durées dans des conditions
expérimentales normales. Profitez pleinement des performances de votre
colonne en l’utilisant conformément aux spécifications techniques. Prenez
toujours le temps de vérifier les spécifications techniques avant de mettre
en place une méthode définitivement.